А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Две составляющие А)тн+ — электрическая и концентрационная — по-видимому, взаимозаменяемы при синтезе ЛТФ; доля каждой из них в процессе синтеза АТФ может быть различна. Преобразование энергии электрохнмического градиента протонов в форму макроэргических связей АТФ осуществляется ЛТФ-снитетазным комплексом хлоропластов Ссп — Сст, связанным с мембранами тилакоидов. Полагают, что энергия А(тпе используется либо на синтез ЛТФ, либо иа высвобождение уже синтезированной АТФ из реакционного центра фермента. Формирование электрохимического потенциала Н+ на мембранах тилакоидов объясняется определенной организацией ЭТЦ и ее локализацией в мембране, В состав ЭТЦ хлоропластов входят переносчики электронов (цитохромы, железосерные.
белки, пластоцианнн), а также переносчики электронов и протонов (пластохиноны). Чередование этих переносчиков и их определенная организация в мембране приводят к возможности разделения заряда на мембране твлакоидов, а также к формированию градиента концентрации ионов между стромальным н внутритилакоидным пространствами хлоропластов на свету Собственная непронвцаемость мембраны для протонов позволяет сохранить индуцируемый на свету электрохвмвческий градиент Н«.
На рис. 15 представлена схема локализации ЭТЦ в мембра. не, отмечены места, связанные с образованием А рН, В формировании быстрого (20 нс) электрического потенциала на мембране основная роль принадлежит реакционным центрам и разделению в них зарядов. Дальнейшее разделение зарядов и образование А рН связано с работой ЭТЦ на уровне пула пластоРис. 15. Расположение электрон.
транспортных комплексов и АТФ-синтетизм в мембране тилакоидои с укзззиием мест трансяокации (обозначеиие пунктиром) протонов; обознзченйя те хсе, что нз рис. 12; СРо — СР« — АТФ-синте- тззный комплекс хинонов, системы фотоокисления воды, восстановления НЛДФ+ (время прохождения этих процессов от 300 мкс до 50 мс), Транслокация Н-« и разделение зарядов на мембране (плюс в на внутренней стороне мембраны, минус — на внешней) приводит к электрогенному движению других ионов (в хлоропластах в основном Мц'«и С1-), направленному на нейтрализацвю этектрнческо ' компоненты элсктрохимичсского потенциала. В стационарных условиях функционирования хлоропластов Атр поддеожьвается на уровне 20 мВ, а основная роль в синтезе АТФ, по-видимому, принадлежит А рН.
Величина А рН )бе 85 „ри этом должна быть не менее 2,5, поскольку расчетная вели«ина А)тнч для синтеза АТФ составляет 125 — 200 мВ. Исследования показали, что существует определенное стехио„1етрическое соотношение между поглощением Нч., потоком электронов и синтезом АТФ (Н+/е=2 — 4; Н+)ЛТФ)3). Процесс формирования на свету электрохимического потенциала может быть выявлен на изолврованных хлоропластах по электрохромному сдвигу в области 515 — 520 нм, связанному с изменением поглощения каротиноидов при энергизации мембран хлоропластов. Фотоиндуцируемое перемещение Н+ извне вовнутрь тилакоидов может быть определено по изменению флуоресценции РН- зависимых красителей, например 9-аминоакридина, а также по фотоиндуцируемому изменению рН в среде при освещении хлоропластов.
В данной задаче используется потенциометрический метод определения фотоиндуцируемого поглощения Н+ суспензией хлоропластов. Установлено, что кинетика и амплитуда фотоиндуцируемых взменений рН в суспензии хлоропластов может быть показателем активности ряда сопряженных с потоком электронов реакций: образования трансмембранного протонного градиента, синтеза илн гидролиза ЛТФ и др. В последние годы потенциометрический метод регистрации изменений РН в суспензии хлоропластов был применен для определения активности циклического фотофосфорилирования; нециклического фотофосфорилирования, сопряженного с восстановлением феррицианида калия; активности АТФаз; скорости реакции Хилла.
Изменение рН реакционной смеси при освещении хлоропластов описывается кривыми, представленными на рис. 15. В смеси, не содержащей АДФ, фотоипдуцируемые изменения рН полностью обратимы прв выключении света (кривая 1). Добавление АДФ в реак- '" ционную смесь приводит к уве- 7 личению амплитуды измене- .=, -1 езкгк ИИя рН. При выключении света рН раствора снижается,,' /„~' ие достигая, однако, исходного Уровня (кривая 2). Это объяс. Ияется тем, что при освещении Рис. 16. Кинетики фотоиинуцируеИзолированных хлоропластов мого изменения Рн и сусиензии хяосреде содерткащей фосфат. Роилестов: 1 — и отсутствие АЛФ, 2 — е присутствии А)ТФ акцепторную систему и кофакторы циклического фотофосфорилировання, происходит изменение кондентрации ионов Не в соответствии с уравнением ЛДФз-+НРО,т — и иН+ — «-ЛТФ' — +НзО т. е.
при фосфорнлировании АДФ число кислотных групп уменьшается, в результате чего происходит подщелачиванпе среды, Таким образом, с синтезом АТФ связано необратимое поглощение протонов из средь!. Специальными исследованиями показано, что в фосфорнлирующих условиях общее изменение рН обусловлено двумя процессами: 1) обратимым в темноте поглощением Нь, происходящим также в отсутствие фотофосфорилпрования ( — АДФ) н связанным с образонанием трансмембраиного протонного градиента, и 2) необратимым поглощением Нь, сопровождающим синтез АТФ в присутствии фосфат-акцепторной системы (ъАДФ). При добавлении в реакционную смесь разобщающих агентов илн ингнбиторов фотофосфорилирояания амплитуда фотоиндуцируемых изменений рН резко уменьшается или исчезает полностью.
Следовательно, скорость фосфорнлирования можно оценивать в суспензии хлоропластов потенциометрически по изменениям рН, которые сопровождают процесс фосфорнлирования АДФ. Цель работы. Определить фотоиндуцируемые изменения рН в суспензии хлоропластов при различных условиях эксперимента. Рассчитать активность циклического фотофосфорилирования хлоропластов в полной фосфорилирующей среде по фотоиидуцируемым изменениям рН среды, Реактивы н оборудование: 50 мМ раствор МяС!г; 250 мМ раствор НзС!; 50 мМ раствор КНгРОи 25 мМ раствор АДФ; 5 мМ раствор ФМС; среда выделения 1 (0,4 М раствор сзхзрозы, 0,01 М раствор )Ч«С1; 0,025 М трнс- НС! буфер, рН 7,8 — 8,0); среда выделения 2 (0,4 М раствор сахзрозы, 0,0! М раствор )ч)аС!, РН 7,8); ! и О,! мМ раствор НС1; ! н 0,1 мМ )ЧзОН; зцетон; центрнфужные нроонрки; ступка с нестнком; цилиндры мерные объемом 25 — 50 мл; конические мерные пробирки объемом 10 мл; тефлоновый гомогеннззтор; пипетки объемом 1, 2, 5 н !О мл; колба Бунзена со стеклянным фильтром № 3; водоструйный насос; полотно нлн капроновая ткщгьч касто«к«; центрифуга ЦЛС-3; нотенцнометрнческзя уст«нонка; спзктрофотометр нлп Спекол.
Объект исследования: нроросткн гороха, пшеницы, кукурузы, выращенные в различных условиях водоснабжения, минерального питания, освещения; растения разного возраста. Ход работы. Выполнение задачи состоит из четырех этапов: выделение хлоропластов; определение фотонндуцируемых изменений рН в суспензни хлоропластон прн варьировании условий реакции; определение количества хлорофилла в суспензии хлоропластов; расчет величины фотоиндуцируемого переноса протонов в хлоропластах. 1 Выделение хлоропласгов Все процедуры выделе!я!я хлоропластов проводят на холоду при 0 — 4'С.
а) Получение гомоггната. Навеску листьев 2 г (предварительно охлажденных в течение 10 — 15 мин в полиэтиленовом пакете или во влагкной! фильтровальной бумаге в холодильнике нли в ступке на льду) размельчают в фарфоровой ступке на льду в течение 1 — 2 мин с 15 мл среды выделения 1. Полученный гомогенат фильтруют через полотно в фарфоровую чашку и переносят в центрифужную пробирку. б) Получение суспгнзиа хлоропластов методом дифферен!(иального г(енграфугироган~т, Фильтрат в центрифужной пробирке уравновешивают с другов центрифужной пробиркой.
Проводят первое центрифугировгние при 100 й в течение 5 мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра, разрушенные клеточные стенки и другие фрагменты, отбрасывают. Супернатант центрифугнруют 10 мин при 1000 д. Полученный осадок (содержпт хлоропласты!) гомогенизируют в центрифужной пробирке кисточкой с !5 мл среды выделения 1 с целью промывания хлоропластов. Проводят центрифугирование — 10 мин при 1000 д. Супернатант отбрасывают, а осадок перемешивают с 2 — 3 мл среды выделения 2 (среда не содгрябиг буфера), переносят в гомогенизатор, гомогенпзируют в нем до получения однородной смеси и затем помещают в мерный цилиндр.
Центрпфужную пробирку и гомогенизатор ополаскивают небольшими порциями среды выделения 2 для полного перенесения хлоропластов в цилиндр. Конечный объем суспензии ,в цилиндре 15 — 20 мл. Суспензпю хлоропластов держат в темноте и на льду. 2 Определение фото!гндуцируелгых азменений рН в суспгнзии хлоропластов 'Опыт проводят на установке, описание которой дано в Приложении П (см.
рис. 31). Реакционную смесь готовят непосредственно в ячейке. Состав реакционной смеси приведен в табл. 16. Конечный объем смеси 20 мл. Таблица 16 Состав реакционной смеси для определенна фвтонндуцнруемых изменений РН хлоронластвмн Объем, «восичыи в ячавау, ил Ковач«а« гсс«вагсграчия в «чозиа, «М Ком«о«а«гы — АД*й - АДФ 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 !3,0 0,4 0,4 0,4 0,4 13,4 ! 5 ! 0,5 002 Мяс), НзС! КНгРОч АДФ, рН 78 ФМС Н«О, рН 8,0 (бнднстнлчнровзнная) Хлороплзсты В опыте используют среду, пе содержащую фосфат-акцсп'торном системы ( — АДФ).
Измерения проводят при варьиро- РАБОТА 1 РЕГИСТРАЦИЯ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ИЗМЕНЕНИИ рН ХЛОРОПЛАСТАМИ В ОТСУТСТВИЕ АДФ 87 ванин рН реакционной среды в интервале 6,0 — 7,0. Изменения рН достигают путем добавления небольшвх количеств (добавлять по каплям!) 1 мМ НС1 или ! мМ гчаОН. После внесения реакционной смеси в ячейку потенциометрической установки н доведения ее до нужного значення РН записывают в темноте начальный уровень рН среды. Затем включают свет и записывают кинетику фотоиндуцируемых изменений рН среды. После этого выключают свет и наблюдают возвращение рН к исходному уровню.
Поскольку хлоропласты в компоненты реакционной смеси обладают буферной емкостью в величина ес завнсит от рН среды, для расчета истинной величины поглощения Нч. хлоропластами на свету прн всех исследуемых значениях рН производят калибровку. Для эзого в реакционную смесь после цроведенвя каждого определсния микропипеткой или автоматической пипеткой добавляюч определенное количество (0,1- — 0,2 мл) НС! известной концентрации (10-" — !О ' М). Отмечают амплитуду изменений рН, соответствующую добавленному количеству протонов, на РН-метре и на диаграммной ленте. Это позволяет определить, на сколько изменяется рН среды прп добавлении известного количества протонов в реакционную смесь (ГзНь)АрН), а также цену деления диаграммной ленты в единицах содержания протонов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
