А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Концентрацию пигментов С рассчитывают по формуле С, г)л=Р)а1, где Р— оптическая плотность при соответствующей длине волны; а — удельный коэффициент погашения, л г-' см — ' (для каротина — 280, лютеина — 258, взолаксантипа -- 225, неоксантина — 227); 1 — толщина слоя раствора, см. 69 Объем лрогпт(графируамыл проб, мл А, мгг'г сырой массы и, отн. сл Объсм алыата, мл и мент е, ил Содержание каротнноидов иа 1 г сырой массы растительного материала А (мг/г) определяют по формуле А = С )7К(Р, где С вЂ” концентрация пигментов, г/л; 1г — объем вытяжки, мл (10 мл); К вЂ” отношение объема элюата к общему объему вытяжки, нанесенному на хроматограммы; Р— навеска растительного материала, г (0,5 г). Оформление работы.
См. Равд. 1, задача 1. Данные опыта поместите в табл. 10. Таблица 1О образующиеся при возбуждении ФСП, используются в реакциях, сопряженных с ФС1. Взаимодействие двух фотосистем осуществляется через промежуточные компоненты ЭТЦ фотосинтеза. ыба рте о е3л йл и— о ц,о|5 Па ) 1 Г "ма д.4Ю 1 ' Пса ЗАДАЧА 3.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХЛОРОПЛАСТОВ На начальных этапах фотосинтеза энергия света используется для переноса электронов ~в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтеза. При этом образуются восстановленные соединения (НАДФ.Н) и АТФ, Эти соединения являются первыми стабильными «консерваторами» световой энергии. В результате фотоокисления воды выделяется молекулярный кислород. В настоящее время доказано, что изолированные хлоропласты являются полноценными фотосинтетическимн структурами и способны осуществлять все этапы фотосинтеза. Световые фотохимические реакции происходят в пигментсодержащих мембранных структурах пластид; фиксация СО и гемновые ферментативные реакции протекают в основном в строже хлоропластов, где сосредоточены и соответствующие ферментные системы.
Организация цепи переноса электронов хлоропластов (ЭТЦ фотосинтеза), наиболее признанная в настоящее время, представлена на рис. 12. Она включает две последовательно протекающие фотохимические реакции, которые осуществляются за счет световой энергии, поглощаемой двумя разными фото- системами: ФС1 — длинноволновой с пигментом Птбб в реакционном центре и ФСП вЂ” коротковолновой с реакцноиным центРом, включающим пигмент Пбэб.
Две фотосистемы осУществляют р азличпые функции. С функционированием ФС! сопряжены реакции фотофосфорилирования и создания мо|цного восстановителя, в то время как ФСП связана с реакциями фотоокисления воды. Продук- 70 лонгу ла.
нц 1- йу 1 чгб ~- и ыа Ог йб Как видно из приведенной на рис. 12 схемы, в обеих фото- Реакциях происходит запасание энергии, а на участке цепи между двумя фотоснстемами — ее высвобождение. Образовавц1иеся молекулы НАДФ.Н и АТФ, в которых световая энергия Преобразована и «запасена» в виде химической энергии, участвуют в последующих реакциях восстановления СО,. Одним из показателей фотохимической активности хлоропластов является реакция Хилла. Она представляет собой комплекс начальных стадий фотосинтеза, связанных с фотоокисле- 71 Рпе. 12.
Схема электрон-транспортной цепи фотосинтеза: Паап — пигмент ревкцпепвбгб центра ФСП; Птоо — пигмент реакционного центра ФС!; П'— возбужденное состоявве пнгмента; Пх — пластохпнея; Пц — пластецпенпп; фд — растворимый ферредбкенв; Фее — феефптпв; Фп — флввопретепн (ферредокспп-НЛДФ-редуктабв); Цнт. Ьыа, Цит. 1 — цптехрбмы; Ао, Аг — первпчвые вкцептбры электронов ФС1; ГеЬл, Резв, Реал — сеяэаявые желевоеерные белки, акцепторы электронов ФС1; Ревев — желеэееерпый белок Риске; й1 — система фетбоккслеппя воды; Ол, Ов — акцептбры электронов ФСП плветбхппбневой кислоты; 2 — донор электронов ФС11; контурами обведены структурно-функциональные комплексы ЗТЦ нием воды, в которых мобилизованные из воды при участии ФСН электроны направляются на восстановление введенных в реакционную смесь акцепторов электронов.
Фотовосстановление акцептора сопровождается выделением кислорода; 2НкО+2А-ь2НеА+Оы где А — акцептор электронов. Эта реакция была открыта в 1937 г. англичанином Р. Хиллом (К. С)11!1) и названа его именем. Он обнаружил, что изолированные хлоропласты при освещении способны восстанавливать железо (Гез"-ьГезт), одновременно выделяя кислород. В дальнейшем было показано, что изолированные хлоропласты могут восстанавливать на свету пе только железо, но и ряд других соединений: окислительно-восстановительные индикаторы, бензохинон, а также естественный акцептор электронов— НАДФ, Таким образом, реакция Хилла, в которой хлоропласты производят разложение воды и восстанавливают какой- либо окислитель, добавленный извне, представляет собой наиболее простую модель первичньгх стадий фотосинтеза В отношении спектра действия, чувствительности к специфическим ингибиторам и различным физическим и химическим факторам реакция Хилла весьма сходна с процессами фотосинтеза в целом.
Поэтому ее использугот в качестве физиологической характеристики состояния растений. На изолированных хлоропластах могут быть охарактеризованы базальыый поток электронов (поток электронов без экзогенной фосфат-акцепторной системы, т. е. без АДФ), сопряясенныи поток электронов (поток электронов, связанный с синтезом АТФ и индуцируемый экзогенными АДФ Фи) и разоби4енньгй поток электронов (поток электронов в присутствии разобщителей, например )чНрС1).
Сравнение скорости реакции Хилла в этих условиях может служить характеристикой работы системы сопряжения синтеза АТФ с переносом электронов в ЭТЦ хлоропластов. Для определения скорости реакции Хилла могут быть использованы полярографический метод, регистрирующий количество выделенного в реакции кислорода, а также спектрофотометрический метод определения скорости восстановления акцепторов электронов. Определение фотохимической активности хлоропластов (независимо от метода) включает следуюп1ие стадии; 1) выделение хлоропластов, 2) проведение реакции, 3) определение сод р ержания хлорофилла в суспензии хлоропластов, 4) расчет фотохимической активности.
Цель задачи. Определить скорость реакции Хилла и исследовать некоторые факторы регуляции фотохимической активности хлоропластов. Объект исследования: проростки гороха, пцгеиицы, кукурузы, выращен- выо в различных условиях водоснабжения, минерального питания, освепгеяии; растения разного возраста; семядоли тыквы; обработанные регулятоРамн роста и Развития растений, РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ РЕАКЦИИ ХИЛЛА В ХЛОРОПЛАСТАХ ПО СКОРОСТИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ АКЦГПТОРА ЭЛЕКТРОНОВ Лдч!епгаром электронов в,реакции Хилла могут быть соли трехвалентпого железа, напРимеР КзРе(СГъР)в (ноРмальный окислительно-восстановительный потенциал Е'=0,36 В), окнслительно-восстановительные индикаторы, например 2,6-дихлорфенолиндофенол (Е'=0,22 В), физиологические акцепторы электронов — хиноны, цитохромы, НАДФт.
Место включения акцептора электронов в ЭТЦ зависит от его окислительно-восстановительного потенциала. Определение активности реакции Хилла хлоропластов по скорости восстановления акцептора электронов основано на различии спектров поглощения окисленной и восстановленной форм акцептора электронов, Восстановительная активность хлоропластов оценивается спектрофотометрически по разности оптической плотности освещенных и темновых проб при определенной длине волны. Скорость реакции может быть изменена путем внесения в реакционную смесь фосфат-акцепторной системы (АДФ) или разобщителя (КН4С1).
Цель работы. Определить в различных условиях эксперимента скорость потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза по скорости восстановления феррицнанида калия Кзге(С)ч)р. Реактивы и оборудование: среда выделения (0,3 М !ЧзС1 в 0,6 М фосфзтном буфорс, рН 6,9)', 0,1 МеС!р., 7,5 мМ К,Ре(СЫ)р! 30 мМ АДат рН 7,8; 20ур-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 1 М СНрСООГчз! 100зр-й и 80Р/р-й растворы ацетона; фарфоровая ступка с пестиком; цеитРифужные пробирки; мерные цилиндры объемом 25 п 50 мл; ргерная пробирка объемен 10 мл; коническая пробирка объемом 10 мл; пробирки, конические колбы объемом !Π— 20 мл; пвпетки объемои 1, 2, 5 и !О мл; стеклянные воронки; колба Бунзена со стеклянным фильтром чз 3; тефлоновый гомогениззтор; полотно; стеклянные палочки; темная банка; лед; бумажные фильтры; центрифуга ЦЛС 3; технические весы; спрктрофотометр (цли Спекол).
Объект исследования: листья гороха. Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Выделение хлвропластав, Выделение хлоропластов производят в водной среде методом дифференциального центрифугирования. се процедуры выделения хлоропластов ведут на холоде при 0 — 4' С. а) Получение гомагенага. Навеску листьев 2 г (предварительно помещают в полиэтиленовый пакет или во влажную ' Возможны варианты среды выделения хлоропластов: 1) 0,3 М !ЧзС! ' 0,06 М фосфзтном буфере, РН 8,04; 2) 0,4 М сахароза и 0,01 М !ЧзС! в 06 М фосфзтном буфере, РН 6,9; 3) 0,4 М сахароза и 0,01 М !ЧзС! в 0 06 М фосфатиом буфере, РН 8,04. 73 Варианты Свет+АДФ Свет+АДФ Темнота+АДФ Темнота+АДФ Свет — АДФ Свет — АДФ Темнота — АДФ Темнота — АДФ Номер колбы 1 2 8 4 5 6 7 8 Примечание. Присутствие и отсутствие АДФ обозначено соответственно знаками + и —. В каждую колбу наливают реакционную смесь.
Составы реакциогпюй смеси приведены в табл. 1! фильтровальную бумагу и охлаждают ~в течение 10 — 15 мин в холодильнике или в ступке на льду) размельчают ножницами и затем растирают в фарфоровой ступке на льду в течение 1 — 2 мнн с 15 мл среды выделения. (Изменение объекта исследования требует применения соответствующей среды выделения хлоропластов. Возможные варианты среды см. в Приложении к этой задаче.) Полученный гомогенат фильтругот через полотно в фарфоровую чашку и переносят в центрифужнуго пробирку, б) Получение суспекзии хлоропластов методом дифференциального цектрифугировакия. Фильтрат в центрифужной пробирке уравновешивают водой с другой центрифужной пробиркой. Проводят первое центрифугирование при 800 об)мин в течение 5 мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра, разрушенные клеточные стенки и друтие фрагменты, отбрасывают.
Супернатант центрифугируют 10 мнн при 3000 обгмин (второе центрифугирование). Полученный осадок (содержит хлоропласты) гомогенизируют в центрифужиой пробирке стеклянной палочкой или кисточкой с 5 мл среды выделения с целью промывания хлоропластов. Проводят третье центрифугирование — 10 мип при 3000 обумин. Супернатант отбрасывают, а осадок перемешивают с 2— 3 мл среды выделения и переносят в гомогенизатор, гомогенизируют до получения однородной смеси, а затем помещают в мерный цилиндр. Центрифужную пробирку и гомогеиизатор ополаскивают небольшими порциями среды выделения для полного перенесения хлоропласгов в цилиндр.
Конечный объем суспензии в цилиндре — 12 — 15 мл. Суснензию хлоропластов хранят на льду в темноте. 2, Проведение реакции Хилла в различных условиях эксперимента, Опыт проводят в конических колбах пеболыпого объема. Ниже приведена схема опыта. Таблица 11 Ваппапты, мл .елдФ Компоненты оа олпу аолбу на оаау колбу 2,85 0,15 1,0 1,0 2,7 0,15 1,0 0,15 1,0 Среда выделения лтиС1, КаГе(Сл)) а АДФ Хлоропласты Суммарный объем реакционной смеси 5 мл, Темновые варианты помещают в темноту, а световые освещают в течение 5 мин на специальной установке (рис. 13).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
