А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 19
Текст из файла (страница 19)
В настоящее время известны два основных типа фотофосфорилировапня; циклическое и нециклнческое. Циклическое фотофосфорилировиние сопряжено с циклическим потоком электронов, при котором удаленный из фотовозбужденной молекулы хлорофилла электрон возвращается к ней по замкнутой системе переносчиков и кофакторов (рис. 14). В реакциях циклического фотофосфорилирования участвует только ФС!. Под действием света электроны возбужденной молекулы хлорофилла (П„о) принимаются акцептором Ло с потенциалом — 0,9В и груплой Ре5-соединени2! (Е'= — 0,7 —: — 0,55 В). Затем электроны переходят к железосодержащему белку ферредоксину, который при этом восстанавливается, а от него— к цитохРом 0о1)-комплексУ.
На послеДнем этапе, РастРатив ю|еР- гию, полученную прн переходе в возбужденное состояние, электроны возвращаются на свои орбиталв в молекулах хлорофилла а. Цикл замыкается. Окисленная форма пигмента восстанавливается и при возбуждении снова может служить источннком для циклического процесса. Во время описанного процесса электроны движутся по градиенту окислительно-восстановительного потенциала. Этот перенос электронов сопряжен с синтезом АТФ. Таким образом, энер- 79 гия света, поглощенная пигментом реакционного центра, фиксируется в виде АТФ.
Процесс циклического фотофосфорнлирования не сопровождается выделением Оз или синтезом носстаиовлениых кофакторов и может быть представлен следующим образом: Спет АДФ+ Фн — ь АТФ. ло ))ц Рнс. 14. Схема циклического фотофосфорнлнровзния; Ав первичный зкцептор ФС1, Птоо — пигмент резкцнонного центра ФС1, Пц — плзстоцизннн, Фд — ферредоксин, Цит. Ьв, Цит. 1 — цитохромы, Ге5— железоссрныс белки промежуточным переносчиком клического фотофоофорилиров феназинметасульфат (ФМС), витамины Кь Кз.
Цель работы. Определить активность циклического фотофосфорилирования в хлоропластах высших растенвй в зависимости от условий выращивания и онтогенеза растений. В качестве кофактора использовать ФМС. Реактивм н оборудоввнне: среда выделения (0,35 М раствор )ЧеС! в 0,05 М тряс-НС! буфере, рН 7,8); 0,6 М раствор НзС1; 0,1 М раствор МпС1в; 0,1 М раствор КН РОв! 1 мМ раствор ФМС; 0,1 М раствор АДФ, рН 7,8; 10%-й раствор ТХУ; 1 М раствор СНзСООИн; 0,2 М зцетатный бчфер, рН 4,0; 1%-й раствор аскорбиновой кислоты в 0,00! мМ Сп50в 5Ноб; 1%-й раствор (ЫНв)вМо04 в 005 н. раствора Нв50в., бидистиллировзннзя вода; 100%-й и 80то-й растворы ацетона; пипетки объемом 1, 2 и 5 мл; 80 г,р й -0,7 3 -фб че -бу К р в й! йг а,л Существует несколько путей циклического транспорта электронов, сопряженных с фотосинтетичсскнм фосфорилированием, Они различаются но включению разных кофакторов и энергетической эффективноств.
Различные пути циклического транспорта электронов обеспечивают наиболее эффективную работу ЭТЦ при изменении условий существования растений. В экспериментальных условиях для образования АТФ изолированными хлоропластами необходимы свет как источник энергии, основные компоненты фосфорнлирующей системы — АДФ, Фн, Мдз+ — и кофакторы, которые служат электронов. К кофакторам циания относят ферредоксин (Фд), флавннмононуклеотид (ФМЙ), цеи итрифужные пробирки; мерные цилиндры объемом 25 и 50 мл; мерные „обиркн объемом 10 мл; коническая пробирка; колба Бунзена со стеклянфильтром Но 3; лабораторные пробирки; миленькие воронки; колбы бъемом 25 мл; стеклянный стакан объемом 50 — 100 мл; ступка с пестиком; объе. тефл лоновый гомогеннззтор; полотна; ножницы; скальпель; бумажные фильтлед; центрифуга ЦЛС-3; весы технические; спектрофотометр; ФЭК.
Объект нсследовнния; проростки горохе, пшеницы и других растений. Ход работы. Определение фотосинтетического фосфорилиронания растений включает четыре этапа: выделение хлоропла„тов; проведение фосфорилирования; определение фосфора в реакционной смеси; определение содержания хлорофилла в суспеизии хлоропластов. 1, Выделен!те хлоролластов. Навеску листьев (4 — 5 г) разьоельчают ножницами, растирают в предварительно охлажденной фарфоровой ступке с 1О-кратным (по массе) количеством среды выделения. После растирания гомогенат отжимают через полотно в фарфоровую чашку и переносят в центрифужную пробврку.
Первое центрифугирование проводят при 1000 об(мин в течение 3 мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра, разрушенные клеточные стенка и т. п., отбрасывают, а надосадочную жвдкость перелинают в друтую центрифужную пробирку. Для осаждения хлоропластов суспензию центрифугируют в течение 7 мин при 3500 об/ыин. Надосадочную жидкость сливают, а полученный осадок хлоропластов суспендируют в тефлоновом гомогеннзаторе с 7 мл среды выделения. Полученную суспензию хлоропластов помеща!от в банку со льдом, защищенную от света черной бумагой. 2 Проведение фотофосфорнлмроаания.
Для проведения фотофосфорилировання готовят реакционную среду, состав которой приведен в табл, 14. Растворы для реакционной смеси, кроме АДФ и ФМС, приготавливают заранее иа бидистиллированной воде и хранят в холодильнике. АДФ и ФМС готовят непосредственно перед опытом, и тогда все компоненты реакционной среды сливают вместе, Реакционную среду готовят сразу на четыре колбы (две опытные на свету в две контрольные в темноте для одного биологического нарванта).
Каждый компонент реакционной смеси берут в пятикратном объеме (табл. 14). В каждую колбу налввают по 2 мл реакционной смеси и 1 мл суспензии хлоропластов. В контрольные колбы сразу добавляют 1 мл раствора ТХУ и 1 мл СНзСООр(а. Опытные колбы освещают в течение 5 мин (схема установки показана на Рвс. 13). Следить, чтобы температура воды в ванне не превыц!ала 20'С. Для ее регулирования можно использовать лед. '!осле освещения в каждую колбу быстро добавляют по 1 мл ТКУ и 1 мл СНзСООНа, Содержимое колб фильтруют через умажные фильтры в пробирки и в фильтрате определяют сод~ржание неорганического фосфора методом Лоури, 81 Таблица !4 Колнчтсыо раствора в колбе, мл Количество я колбе, и моль Компоненты 0,9 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,6 45 60 10 10 !О 0,1 Трио-НС! буфер, РН 7,8 — 8,0 !ЧаС! Мцс),.
Гй Н,О АДФ, рН 7,8 ' КНтРОч. 2НтО ФМС НаО (бидистиллированнан) 2,0 Обпгнй объем Таблица 15 Иаиеиснне содер- м.ии» фосфора,мкг Аг 'ивноать фатттфасФарнлнрааания, чкмаль фосфора аа 1 ч гагат тлорафилла Концентрация фосфора Мап т- рельопьгг1, мкг1мл Опти- ческая плот- ность Концен- трации фосфора, игк/тгл Варианты опыта «Ь ° а им к Темнота (контроль) 1 2 Свет (опыт) 1 2 82 Состав реакционной среды для циклического фбтбфосфорнлнрбвания 3. Определение неорганического фосфора в реакционной, смеси по методу Лаури К 0,5 мл фильтрата добавляют 1,5 мл бидистиллированной воды Затем в пробирку прибавляют 2 мл СНнСООР(а; 4 мл ацетатного буфера; 1 мл аскорбиновой кислоты.
ь!врез !О мин приливают 1 мл раствора (!т)Н4)еМООч. Через 10 мвн плотность раствора фосфорномолибдеповой сини измеряют па ФЭКе в кювете 0,5 см с красным светофильтром (контроль — вода). Концентрацию фосфора в растворе определяют по калибровочной кривой. Показателем фосфорилврующей активноств хлоропластов служит убыль неорганического фосфора за время внкубации. Фосфорвлирующую активность изолированных хлоропластов выражают в микромолях фосфора за 1 ч в расчете на 1 мг хлорофилла.
4, Определение хлорофилла в суспензии хлоропластов. Для расчета фосфорилиру1ощей активности хлоропластов на 1 мг хлорофилла необходимо определить содержание хлорофилла в 1 мл суспензви. С этой целью к 1 мл суспензии хлоропластов добавляют 1 мл НнО н 8,0 мл 100б(б-го раствора ацетона. Раствор фвльтруют через стеклянный фильтр № 2 или № 3. Затем объем фильтрата доводят 80п(б-м раствором ацетона до 10 мл и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при ).=-552 нм (контроль — 801)б-й ацетон). Содержание хлорофилла в мвллиграммах в 1 мл исходной суспензвв можно рассчитать, умножая оптическую плотность а)нбн на коэффициент К: 10 К=- =-0,290, 34,5 1,О Оформление работы. Результаты обобщите в виде таблицы (см.
табл, 15). Для подробного оформления задачи см. равд. 1, задача 1. ЗАДАЧА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ИЗМЕНЕНИЙ РН В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Фотоиндуцнруемын перенос электронов по ЭТЦ фотосинтеза сопровождается формированием на мембранах тнлаковдов градиента электрохимического потенциала зонов водорода А)!в+. Этот потенциал складывается из разноств электрического потенциала Аф и трансмембранной разности рН (А рН): А)сна =В Лтр — 2,3ртТ А рН. Согласно хемиосмотической гипотезе Митчела, поддерживаемой в настоящее время многими учеными, этот электрохимический градиент протонов служит движуи(ей силой синтеза АТФ В ХЛОРОПЛаетатн Для начала синтеза АТФ в хлоропластах необходимо формирование А рН, равного 2,5 — 3,0, и А1р, равного 100 мВ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
