А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Реактмзы и оборудование; 06%-0 раствор этилового спирта нлн 30%-й раствор ацетона; МКСОю (СзСОю); кварцевый песок; фарфоровые ступки с пестиками; скальпель; ножницы; пинцет; стеклянные палочки; коба Бупзепз со стеклянным фильтром ъГю 3; мерные колбы объемом 26 мл; мерный цьлнндр объемом 26 мл; стеклянные воронки; конические пробирки; пипетки объемом 2 и б мл; фольга; весы торспонпые, спектрофоюометр.
Объект исследования: листья растений разных световых экотппоз; листья плп хвоя одного и того же растения, рзстущпс при разном световом рюгкпмо (листья внутри кроны, нз верхушке побегов и т. д.); листья разного зозРаста. Ход работы. Для решения задачи необходимо провести зкстракцию пигментов и определить на спектрофотометре их концентрацию. Навеску растительного материала (100 — 200 мг) размельчают ножницами, помещают в маленькую ступку, добавляют на копчике скальпеля немного МЯСОз, приливают 4 — -5 мл ацетона и тщательно растирают. Полученную вьпяж- ' С...
— концентрация каротиноидоз. 61 ку сливают по палочке на стеклянный фильтр, вставленный в колбу Бунзена. При помощи насоса жидкость отсасывают. После этого в ступку приливают еще немного ацетона, растирают, снова вливают на фильтр и отсасывают. Эту операцию повторя|от несколько раз, пока раствор, стекающий из фильтра, не будет абсолютно бесцветным.
Вытяжку переливаю| в мерную колбу, колбу Бунзена ополаскивают несколько раз небольшими порциями ацетона и доводят чистым ацетоном объем вытяжки в мерной колбе до метки. Работа ко.тнчественная, нельзя терять ни одной капли! Полученная ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых ь желтых пигментов. Концентрацию хлорофиллов а и Ь определяют на спектрофотометре. Для этого часть полученного экстракта наливают в кювету спектрофотометра. Вторую кювету, заполненную чистым растворителем (80о)о-й раствор ацетона), используют как контрольную.
Кюветы помещают в кюветную камеру спектро. фотометра и определяют оптическую плотность 72 вытяжки прн длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хло. рофиллов а и Ь в 80з|о-и растворе ацетона, 663 и 646 нм. Для определения каротиноидов вытяжку промеряют при К=470 ни Концентрацию хлорофиллов а, Ь и каротиноидов рассчитывают по формулам; Сь = 12,2117заз 2 8 11г)зм; Сь = 20,137)зьз — 5,03Взаз,' 10007)пь -- 3,27С, — 100Сь Си, = 229 где С„Сь и С„р — концентрация хлорофиллов а, Ь и кароти ноидов, мг/л.
Затем вычисляют содержание пигментов Л в растительном материале, мг)г сырой массы: Л =)7С)!ОООР, где С вЂ” концентрация пигментов, мг/л; )7 — объем вытяжки, мл (25 мл); Р— навеска растительного материала, г (0,1— 0,2 г). Оформление работы. См. равд. 1, задача 1. РАБОТА 2. ИССЛЕДОВАПИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ СВОИСТВ ХЛОРОФИЛЛА Цель работы. Исследовать ряд свойств хлорофилла. Реактивы и оборудование: те же, что в работе 1 данной задачи; бензин; 20с(ь-й спиртовой раствор щелочи; !Оь)ь-й раствор НС!; КОН: (СН|СОО) з2п нли (СН,СОО) зСп; регистрирующий спектрофотоиетр.
Объект исследовании: те же, что в работе 1 данной задачи, ОПЫТ 1. ФЛУОРЕСПЕНЦИЯ ХЛОРОФИЛЛА Флуоресценция — явление свечения веществ при поглощении ими света. Переход возбужденной молекулы пигмента в Основное исходное состояние сопровождается излучением поглощенной энергии в ~виде света флуоресценпии. Излучаемый свет имеет ббльшую длину волны, чем поглощаемый. Для хлорофилла характерна красная флуореецепция.
Ход работы. Получить вытяжку пигментов, как описано в работе 1 данной задачи. Вытяжку пигментов помещают на черном фоне у окна или освещают спне-фиолетовым светом в области коротковолнового максимума хлорофилла. Вишнево- красный цвет вытяжки в отраженном свете свидетельствует о способности хлорофилла флуореспировать, что является признзком фотохимической активности ве|цества. ОПЬП Е РЛЗДЕЛЕИИЬ ПИГМЕНТОВ ПО КРАУСУ й!етод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Сродство пигментов к полярным (спирт, апетон) и неполярным (бензин) растворителям определяется степенью их полярности. Ксантофиллы, содержащие две или более полярных групп, хорошо растворимы в спирте, в то время как каротин отличается более высоким сродством к бензину.
Фитольный остаток,в молекуле хлорофилла представляет ее гидрофобную часть и обусловливает возможность взаимодействия молекулы пигмента с бензином Удаление фитола при Омылении хлорофилла увеличивает сродство пигмента к полярным растворителям. Ход работы. В пробирку наливают 2 — 3 мл спиртовой вытяжки пигментов, прибавляют примерно полуторный объем бензина и несколько капель воды для того, чтобы спирт не смешивался с бензином Пробирку закрывают и несколько раз сильно встряхивают, а затем ставят на 2 — 3 мин. Происходит разделение слоев: верхний зеленый слой (бензиновый) содержит оба зеленых пигмента и квротин, нижний желтый слой (спиртовой) — ксантофиллы.
Определяют спектр поглощения ксантофилла. Показателем чистоты отделения ксантофилла от зеленых пигментов является отсутствие поглощения в красной. Области спектра. Т!ПЫТ 3. ОМЫЛЕНИЕ ХЛОРОФИЛЛА И 01ЩЕЛЕНИЕ КЛРОТИИЛ Ход работы. В пробирку с 2 — 3 мл вытяжки пигментов прибавляют несколько капель 20о)о-го спиртового раствора щелочи. Наливают 1 — 1,5 мл бензина и две капли дистиллированной воды. Сильно встряхивают, а затем дают отстояться.
Нижний, сниртовой, слой содержит соль хлорофиллиновой кислоты (продукт омыления хлорофилла) и ксантофилл, верхний, бензиновый, слой — каротин. Определяют спектр поглощения каРатина. 62 63 Можно произвести омыление н после разделения слоев по краусу. Для этого в ту же пробирку прибавляют кусочек щелочи, встряхивают и наблюда1от перемещение хлорофилла из верхней фазы (бензин) в нижнюю !Спирт), Реакция хлорофилла со щелочью идет следующим образом: 1ООСН, л С, Нь,ОЬА1З вЂ” зч.о1 - СП.,ОН 4 С.„Н,,ОН С.,Н, ОЬ,М ° 'СООС „11., соон. ОПЫТ К ПОЛУЧЕНИЕ ФЕОФИТИНЗ И ВОССТЛНОНЛЕ1П!Г МЕТЛЛЛООРГЛНИЧЕСКОЙ СВЯЗИ Ход работы. В пробирку наливают 2 — 3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавляют 1 — 2 капли 10%-го раствора НС1.
При взбалтывании вытяжка становится бурой вследствие образования производного хлорофилла — фгофитипа 1в хлорофилле атом магния замещается водородом). Реакция идет по следующему уравнению: соосн / 3 l соосн; С1Н ОЧ МК И за + 2НС1 —. С„Н,„ОЬ,Н, "' сооснн „ соосз,н,„ К побуревшей вытяжке прибавляют несколько кристаллов уксуснокислого цинка или меди, осторожно нагревают на водяной бане и наблюдают появление зеленой окраски благодаря восстановлению металлоорганической связи.
Оформление задачи, См. равд. 1, задача 1. В каждом опыте опишите свои наблюдения и на их основании сделайте заключение о физических и химических свойствах хлорофилла. РАБОТА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОИСТВ ПИГМЕНТОВ В РАСТВОРЕ И ТКАНЯХ ЛИСТА Пигменты фотосинтетического аппарата локализованы в мембранах и образуют пигментбелковые комплексы отвечающие за поглощение света и передачу его энергии в реакционные центры. Пигмент-белковые и пигмент-пигментные взаимодействия, происходящие в мембранах, обусловливают изменение спектральных свойств пигментов.
Зто ведет к образованию набора различных форм пигмента, обладающих одной и той же химической структурой, но отлича1ощихся спектрами поглощения !например, хлорофилл аззь амз, азз4 и др.). Такое разнообразие форм ведет к увеличению спектральной области поглощения фотосинтетического аппарата, т. е, более полному поглощению света, и обеспечивает возможность эффективного направленного переноса энергия света наиболее длннноволновым формам хлорофилла а реакционных центров.
Цель работы. Сравнить спектры поглощения пигментов в растворе и в листьях высших растений. Реактивы и оборудование: те же, что в работе 1 данной задачи; регистрирующий спектрофотоиетр Сф-14 или СФ-18. Объект исследования: листья растений различных экотипов; листья растений при различной степени формирования и деградации фотосинтетнческого аппарата (этиолиронанные и зеленеющие проростки кукурузы, осенние кистьн клена, каштана к др.). Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Приготовление ицетоновой и спиртовой вытялски пигментов из листьев.
Способ приготовления вытяжки пигментов описан в работе 1 данной задачи. В качестве экстрагирующего раствора используют 80з1е-й раствор ацетона и 96%-й раствор этилового спирта, 2 Регистрация спектров поглои4гпия а спектрофотометре, Порядок работы на регистрирующих спектрофотометрах описан в Приложении П. Спектры поглощения растворов пигментов и листьев записывают на одном бланке. Для снятия спектров поглощения вытяжки пигментов их раствор наливакзт в кювету, укрепляют в к1оветоцержателе н помещают в правую часть (по ходу луча) кюветного отделения спектрофотометра. В контрольную кювету наливают чистый растворитель. На барабане укрепляют бланк, строго следя за точностью совмещения линии 400 нм на бланке и на шкале прибора. Производят запись спектра. Для регистрации спектра поглощения живого листа его помещают в специальные круглые кюветы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
