А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Такое превращение сопровождается потерей физиологического и биохимического статуса исходной ткани. В ходе дедифференцировки изменяются ультраструктура я метаболизм клетки. При этом увеличивается число полисом Р элементов эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, одновременно интенсифицируется синтез РНК и ДНК, изменяется состав белков. В процессе дедифферснцировки клеток особую роль играют фитогормоны — ауксипы и цитокинины.
Если в среде присутствует только ауксин, клетки, пройдя этап активации синтеза РНК и начало синтеза ДНК, не переходят к делению, а вместо этого через какое-то время начинают расти растяжением. Если же в среду добавлен только цитокинин то в клетках не происходит активация синтеза ДНК и РНК и также не начинается деление. Таким образом, в клетке существует двойной гормоиальньгй контроль делеыия ауксин подготавливает клетку к делению, которое затем запускается цитокинином. Ауксин необходим для перехода специализированной клетки из фазы По в 5-фазу клеточного цикла, цитокинин— для завергпения этой фазы и прохождения последующих фаз бь А4 и цитокинеза (Бутенко, 1975, 1987).
Первичный каллус, возникший .на экспланте, после того как он подрастет, переносят на свежую питательную среду, Такие регулярные пересадки в дальнейшем дают возможность поддерживать культуру достаточно долго. Материал для эксплантации и получения каллуса можно брать из разных частей растения, однако в каждом случае приходится подоирать условия культивирования. Состав некоторых часто применяемых питательных сред приведен в Приложении 1. При определенных условиях в каллусах можно индуцировать морфогенез с образованием листьев, корней, побегов, цветков или зародышей, из которых могут развиваться целые растения (см.
рис. 5). Такой переход к организованному развитию можно вызвать, изменяя баланс фитогормонов. Инициация морфогенеза сопровождается изменением типа клеточных делений. Клетки вступают в деление вновь,и вновь, не переходя к росту растяжением. В результате этих процессов закладываются центры организованной меристемы. Они состоят нз клеток, отличагощихся от каллусных значительно меньшими размерами, более плотной цитоплазмой н болыпим ядерно- плазменным отношением (Бутенко, 1975). Образование организованных меристем и направление их развития также зависят от соотношения ауксинон и цитокининов, Если в среде преобладают ауксины, формируются корневые меристсмы, при обратном соотношении фитогормонов образуются стеблевые почки и побеги.
Регуляторное действие фптогормогюв зависит от ряда факторов, например концентрации и вида сахаров, включенных в состав среды, источника азота и фосфатов и т. п. Цель работы. Получить первичный каллус из листьев и черешков моркови. Пересадить каллус для поддержания культуры. 40 Реактивы и оборудование: стерильные чашки Петри; скальпели; нож цы пинце™ лопатка или ложечка банки объемом бб †(бб вга изованн ю р У среду А(С с добавлением гормонов (объем среды об — 4О л), — мл, содержащие Объект исследовании: стерильные проростки и квллус 0аисив саго(а, сорт Нантскан, тки и каллус моркови Ход работы. Работа требует стерильных условий и сс про- водят в ламинар-боксе.
Из пробирки достают стерильное ра- стение пинцетом и помещают его в чашку Петри. С помощью пинцета и скальпеля или ножниц отрезают листья моркови и разрезают черешки листьев на части, длиной около 1 см. Во время этой процедуры необходимо следить за тем, чтоб ки не находились над стерильной поверхностью чашки нли растением.
Затем открывают баночку со средой и пинцетом переносят на среду листья нли кусочки черешков. В баночку вносят по три экспланта. Закрывают банку обожженной к ыш- кой из фольги, сверху накрывают целлофаном, подписывают и помещают в термостат с освещением 400 лк и температурой р, 4 — 6 недель производят пересадку образовавше- гося каллуса на свежую питательную среду. Для пересадки первичного каллуса или поддержания куль- туры используют лопатку, с помощью которой каллус перено- сят в банку со свежей средой. На 50 мл питательной среды обычно переносят 100 — 130 мг каллуса. Срок переноса калл- са на свежую среду зависит от скорости его роста; обычно эту процедуру повторяют каждые 4 — 6 недель. Оформление результатов.
Опишите все проделанные опера- ции, обращая внимание на характеристику объекта. РАБОТА 3. ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК РАСТЕНИИ (СУСг(ЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА) Суепешзионная культуре — это культура клеток, выращиваемых в перемешиваемой жидкой питательной с е . С ы выращивания, применяемые в микробиологии, используют и для культивирования растительных клеток. Клетки разных видов растений в этой культуре ведут себя сходным образом и существенно отличаются от клеток исходной ткани.
Обычно культура состоит из отдельных клеток и агрегатов различной величины (от 2 до 50 клеток и более). В суспепзионной культуре моркови встречаются следующие типы клеток остиночные растянувшиеся клетки, часто ~изогн той формы, содержащие огромную вакуоль и пристеночный слой цитоплазмы с крупным ядром; клетки гиеньшего разлсе а, ру .. или овальные, в той или иной степени вак олизи ованные, с бо,. с более плотной цитоплазмой, одиночные или ля неся гц я и образующие агрегаты.
Степень агрегированности клеток в суспензии зависит от условий культивирования. Для изучения суспензии клеток кусочки каллуса переносят с полутвсрдой среды в жидкую и культивируют при перемешивапии на качалке со скоростью 90 в 120 об/мин. ,/ 42 Кривая роста клеток и культуре имеет 8-образную лл форму (рис.
6). В начале й культивирования при резком изменении условий сущестнопания клетки испытывают стресс. В этот момент наблюдают резкое усиление дыхания Затем наступает лагфаза, которую рассматривают как адаптационную к новым условиям роста. Ее Время длительность зависит от объема и состояния инокуРнс. 6. 'кривая росте клеток в культуре 1 — лвг-фззз, 2 — зкспоненцнзльнзя фззз, 3 — фаза замедленна культивирования. В этот пероста, 4 — стзцнонзрнвя фззз, б — риод клетки актиино меняют фаза отмирания попУляции клеток рН среды до оптимального ,для данной культуры; они характеризуются высокой интенсивностью дыхания, высоким энергетическим уровнем, ако синтезиру1от ДНК, РНК и белки.
Мнтотический индекс тиино синтези у низкий. Максимальный рост клеточной популяции проис д следующей экспоненциальной фазе, когда митотическая активность достигает наибольшей величины. Удельная скорость роста сн~ижается при переходе н следующую ф у —. ния роста. В это время уменьшается интенсивность дыхания, увеличивается синтез веществ вторичного ме г метаболизма, возрастает рН культуральной жидкости. Часть клеток дифференцируется, увеличивается число крупны у . р х нак 'олизированны.
клеток. т о . Затем наступает стационарная фаза, когда деградация ью о и их об азование происходят с одинаковой скорост и, наконец, следует фаза отмирания популяции к леток (Липский, 1981; Бутенко, ! 987) . Основные требования для роста и подгуерасания культуры следующие: постоянные температура режим перемешииании и аэрация, период субкультивироиания, количество и физиологическое состояние инокулюма. Для б,, у большинства культур нео ходима т б температура 20 — 30'С, скорость качаний 90— — н записи- 130 об1мигй период субкультиниронания 10 — 14 сут (н мости от объекта и скорости его роста).
Минимальный объем ннокулюма, необходимый для роста кул Ур ьт г ы, зависит от нида объекта, фазы роста и состава культуральной среды. Прн использовании слишком большого объема инокулюма рост клеток может быть угнетен из-за недо у р статка с бстратон или накопления токсических продуктов обме . Д. у на.
Для суспензионной культуры моркови оптимальная конц р ент ация 0,5 — 2,6Х Х10' клеток/мл. Цель работы. Получить и субкультиниронать суспензиоиную культуру клеток моркови. Реактивы н оборудование; стерильные колбы со средой МС, содержащей гормоны. Объем среды составляет 10 — 20ей от объема колбы. Лопатка нлн ложечка; пннцет; стерильные пипетки обьемом 5 — 10 мл; стерильные цнлпндры объемом 10 †н 00 †!00 мл; воронки; сита с диаметром пор 500 мкм, Обьект исследования: кзллус н суспензноннвя культура моркови Оааааз сага1а, сорт Нантская.
Ход работы. Работу проводят н асептических условиях. Для получения первичной суспензии кусочки каллуса переносят прокаленной и остуженной лопаткой в колбу с жидкой средой МС; 1 — 3 г ткани на 60 — 100 мл среды. Используют только молодой, активно растущий, светлый каллус, отбрасывая побуревшие старые участки. Рыхлые каллусы легче переводятся а суспензионную культуру, чем плотные. Плотную каллусную ткань предварительно разделяют на небольшие кусочки диаметром 3 — 4 мм. Колбу после переноса каллуса закрывают предварительно обожженной крышкой из фольги, крышкой из целлофана, подписывают и помещают на качалку с темпе- ' ратурой 26'С, скоростью персмешипания !20 об/мин, прн освещенности 700 лк.
Если н течение первых нескольких суток среда становится мутной, это признак бактериального заражения во время инокуляции. Первичную суспензию обычно культивируют 7 — 1О сут и перед перссеном фильтруют через дна слоя марли или сито, чтобы удалить крупные нераспавшиеся куски каллусной ткани. В большинстве случаев при субкультивировании используют культуру клеток н конце экспонецциальной фазы роста.
Прн культивировании в колбах на качалке это примерно приходится на 14-е сут. Объем инокулюма составляет 10 — 20ого от общего объема суспензни н начале культивирования. Для перссева первичной суспензии сначала оснобождают от фольги стерильную воронку и сито (руки не должны касаться воронки н сита, необходимо пользоваться пинцетом), помещают воронку н цилиндр (объемом 50-- 100 мл), на воронку ставят сито или укладывают диа слоя стерильной марли и затем фильтруют суспензию клеток. После этого 5 — 20 мл (в зависимости от объема колбы со свежей средой) отфильтро|нанной суспензии переносят пипеткой или цилиндром и колбу со свежей питательной средой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
