А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Среда для культивирования протопластов сложнее по составу и включает макро- и микроэлементы, сахара, витамины, органические кислоты, аминокислоты, гормоны. Температура и время выделения протопластов варьируют в зависимости от объекта. Цель работы. Получить протопласты из листьев злаков и определить их жизнеспособность. Реактивы и оборудование: среда для выделения цротоцлзстов, содержащая 90 г?д мииеита, 190 мг?л К)40з, 147 мг/л СаС! 2Н О, 37 ! 17 мт?л КНзРОз и ферменты (2,5%-й раствор цедзюиззы Онизука 17 10, 0,3%-й раствор пектииззы) рП 5,7; 0,3%о-й раствор иейтральиого красного, рН ?,О, цриготовлеццого из среде выделения без е- Б- раствор синего Эванса, рН 7,0, приготовленный нз среде иыи ез "ердедевия без ферментов; раствор флуоресцецндиацетвтз (ФДА) — 2,5 1 мл а е ц тона, хранящийся при 0 С в темноте; лезвия; пинцеты; б ы тз — , мг нз юксы или р; пип тки; покроиные н предметные стекла; цеитрнфужиые пробирки; сита с диаметром цор 80 и 400 мкм; весы; центрифуга; микроскопы студенческие; флуоресцентный микроскоп; камера Фукса — Розенталя; термоОбаект исследования: листья 7 — 10-диеииых проростков пшеницы или Ход работы.
Работа состоит из двух этапов. 1. Выделение вгротопластое. Лист злака, такого, как пшеница, состоит из трех главных типов клеток: мезофилла (40оуо), проводящих (37о1о) и эпидермальных '(23о!о) тканей. Протопласты мезофилла изолируются из листьев легко, быстро и с большим выходом. Суспензия протопластов мезофилла достаточно гомогенна, но в ней могут также присутствовать в небольшом количестве протопласты из других типов клеток. Молодые полностью развернувшиеся листья обрезают по 1 см с обоих концов и берут навеску 0,2 г. Каждый лист разрезают на кусочки длиной около ! см.
Кусочек разрезают вдоль жилок на полоски шириной менее 1 мм таким образом, чтобы небольшой кусочек листа остался неразрезанным и из всего куска образовалась «гребенка». Этн «гребенки» помещают на поверхность среды выделения (5 мл), и сосуд с ними ставят в термостат при температуре 30'С. Время иикубации 2,5 — 4 ч, После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов пропускают через сита или капрон для удаления остатков клеток, затем протопласты центрифугпруют при 100д в течение 5 мин. Осадок протопластов промывают 3 раза раствором среды, не содержащей ферментов, и суспендируют в 1 мл этой же среды.
2 Определение жизнеспособности протопластов. Жизнеспособность протопластов оценивают по их способности накапливать нейтральный красный в вакуолях. Для этого суспензию протопластов смешивают с 0,3о1Ь-м раствором нейтрального красного, который приготовлен на среде выделения протопластов, не содержащей ферментов. Разбавление красителя должно дать конечную концентрацию 0,Обоз. Через 5 мин после окраски протопласты рассматривают под микроскопом и с помощью камеры Фукса — Розенталя подсчитывают количество жизнеспособных протопластов: их должно быть не менее 200. Для окраски можно также использовать 0,5о1о-й раствор синий Эванса (конечная концентрация 0,25сгго) или 0,017о-й раствор фенасафранина.
Эти красители не окрашивают живые клетки. Определение жизнеспособности протопластов по окрашиванию ФДА основано на том, что молекулы красителя легко проникают в клетку через плазмалемму, в живых протопластах расщепляются эстеразами с образованием флуоресцеина (флуорохроматиыеский тест).
Флуорссцеин накапливается внутри протопластов с интактными мембранами. Благодаря возбуждению накопленного флуоресцеина жизнеспособные протопласты становятся различимыми по зеленому свечению в люминесцентном микроскопе. Для определения жизнеспособности протопластов смешивают равные объемы суспензия протопластов и разбавленного раствора ФДА. Разбавленный раствор готовят, добавляя одну каплю исходного хранящегося раствора к 10 мл среды выделе- 20 ния протопластов. Через 5 мин анализируют под флуоресцентным микроскопом окрашенную суспензию протопластов. Оформление работы. Рассчитайте процент жизнеспособных протопластов от их общего количества. Зарисуйте внешний вид протопластов.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Бвпгвльсон Л. Д. Мембраны, молекулы, клетки. М., 1982. Дв Дюв К. Путешествие з мпр экявой клетки. М., 1987. Гэлстон А., Дэвис П., Сэтгвр Р. Жизнь зеленого растения. М., !983. Капая Н. Двяжеггяе протоплазмы. М., 1982. Полевой В. В Физиология растеяяй. М„1989. Саламатова Т. С, Физиология растительной клетки. Л., 1983. Нравы Х. Б. М!сго1пЬп1ев. ТЬе су1оя1ге!е1оп гп р1вп1 егояг1Ь зпг1 г!ече!орптеп1. Асзб. Ргезк 1., 1982. Еео!!1 Т. Резропяе ог р1згцв 1о епч!гопшеп1з! в1гевя. СЬей!пд, !геемпд зпб ЫКЬ !ешрегз1пге з1геввея. Асзб. Ргеяв,, Ы.-У., 1980.
Чо1. 1. Т.М С. У., Сава У. М., Кву Т. !. 8о1п1е 1ез1гзее 1п воуЬезп вееб11пев опбег чапопв Ьез! вйосй гее!шея.— Р!яп! Се!1 РЬуя1о!., 1988. 1го1. 26. Р. 1493— 1498. йгаепвг О. Ае1ошуоя!п зз а Ьзыс шесйвп!вш о1 шочешеп1 !и апппз1в зпб р!зп1в. РЬувю!оку о1 шочешеп1в. Епсус!ореб!в о1 р!вп1 рЬув!о!ойу. Нзгмагд, 1979, ч'о1, 7, Раздел 11 РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ Развитие организма представляет собой процесс реализации.
генетической информации, имеющейся в зиготе, и включает становление многоклеточпостн, дифференциацию клеточных комплексов в мпогоклеточной системе и нх последовательные морфогенетические изменения. Процесс развития подразделяют на следуюгцне этапы: формирование зародыша, превращение его в ювенильное растение, образование взрослого растения, которое может переходить к генеративной стадии (этот этап завершается формированием половых клеток — галет, сливающихся при оплодотворении с образованием зиготы).
У однолетних растений далее следуют процессы старения н гибели организма. У многолетних структура отдельных этапов развития сложнее; они протекают более продолжительное время, и переход в гснеративную фазу развития осуществляется многократно на протяжении жизни растения. Программа развития организма включает большое число относительно автономных подпрограмм, например формирование листа, корня, цветка и т. д. Реализацию отдельных взятых подпрограмм можно наблюдать в опытах по культуре тканей и органов, а также в естественных условиях — в процессе вегетативного размножения с помощью черенков или листьев, в случае «живорождения», например у бриофнллюма, н др. Рост представляет собой одну из составляющих процесса развития и проявляется в необратимом увеличении размеров н массы клетки, органа илн всего организма, которое связано с новообразованием элементов их структур.
Каждый переход от одного этапа к другому, а также процесс развития в целом контролируются факторами внешней среды, одним из которых является свет (например, светозависимая индукция генеративного развития), и внутренними факторами, в перную очередь фитогормонами. Фигогормоны — относительно низкомолекулярные органические соединения природного происхождения, запускающие сложную последовательность биохимических реакций, конечным проявлением которых является изменение морфологии и (нли) физиологии ткани или органа.
Например, ауксин подавляет рост .боковых почек, влияет на ориентацию боковых побегов, процессы корнеобразования. Цитокинин индуцирует образование стеб- левых почек, тормозит образование боковых корней, стимулирует рост листьев, семядолей. Цнтокинин н абсццзовая кислота (ЛБК) регулируют изменение ширины устьичной щели: АБК закрывает устьица, цитокипин открывает их.
Как правило, фитогормоны образуются в одних клетках или тканях, а действуют в других, причем в очень низких концентрациях (10 — '— 10 ш М). Однако они могут действовать и в той ткани, где синтезируются. В регуляции того или иного физиологического процесса участвует несколько типов гормонов (как в рассмотренном примере с устьицами). Фитогормоны влияют на клетки, которые обладают компетентностью к ним. Компетентность, т. е. способность специфически отвечать на воздействие гормона, определяется прежде всего наличием в клетках рецепторов фитогормонов.
Предполагают, что первый этап взаимодействия гормона с клеткой включает образование гормонрецепторного комплекса. Выделение и исследование рецепторов фитогормонов и определение функциональной роли гормонрецепторного комплекса составляют в на.стоящее время одно из наиболее актуальных направлений в изучепии механизма действия гормонов. Регулирующее действие гормонов может быть продемонстрировано в опытах по культивированию клеток, тканей и органов на искусственных питательных средах. Используя разные комбинации гормонов и варьируя их концентрации, можно заставить соматическую клетку реализовать программу развития зиготы с образованием зародышеподобной структуры, которая разовьется во взрослое растение; можно также вызвать образование отдельных органов (корней, цветков и т. д.) либо отдельных тканей, например ксилемпых элементов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
