А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Действие ауксина на рост уже на первых этапах включает механизм восстановления клеточных стенок, что отличает его от «кислого роста» (Полевой, 1982). Действие ауксина, как и других фитогормонов, зависит от концентрации. Увеличение концентрации ауксина выше оптимальной приводит к замедлению роста. На некоторых объектах показано, что увеличение количества ауксина стимулирует образование этилена, который вызывает задержку роста в длину. Цель работы. Изучить влияние ауксинов на рост отрезков колеоптилей.
1 .Ь оггмл, поч 31 Реактивы и оборудование: 5 мМ калийфосфатный буфер, РЕ! 6,0; раствор 5-индолилуксусиой кислоты (ИУК) или 2,4-дихлорфеиоксиуксусиой кислоты (2,4 Л) иа 5 мМ калийфосфатном буфере, рН 6,0 в концентрации 100 мг)л1 лезвия; чашки Г!етри; стеклянные каниляяры; пластилин; алодочки» вЂ” узкие стеклянные кюветы. Объект исследования: отрезки колеоитилей пгиеиацы !овса, кукурузы) в фазе растяжения. Ход работы.
Выбирают проростки пшеницы (выращенной в темноте в течение трех дней) одного размера, отделяют колеоптнли (нужцо брать только цслыс колсоптилн), укладывагот их на линейку и отрезают лезвием сегмент длиной 5 мм, отступая от верхушки 4 мм. Из отрезка колеоптиля капилляром удаляют первичный лист и помещают отрезок в чашку Петри с водой. Набрав достаточное количество отрезков, нанизывают их по 5 шт. на стеклянный капилляр и надевают на кончики капилляра шарики нз пластилина (чтобы удержать отрезки на капилляре). Приготавливают набор концентраций ауксина (100, 20, 1О, 5, 1, 0,5 мг1гл) 1на калийфосфатном буфере. Контрольный буфер не содержит ауксина. Измеряют на капилляре длину всех отрезков колеоптилей, сложенных вместе, записывают и помедцают капилляр в лодочку с определенной концентрацией ауксина.
Лодочку ставят в термостат с температурой 25 С и отмечают время. Через 2,5 — 3 ч с помощью пинцета вынимают ка.пилляр и измеряют длину всех отрезков колеоптилей. Для определения динамики роста отрезков колеоптилей злаков под влиянием ауксинов проводят измерения прироста через каждые 10 мнн в течение 60 — 80 мин. Чувствительность метода повышается, если прирост отрезков измерять в аппарате для чтения микрофильмов с увеличением в 16 раз. Оформление работы.
Полученные результаты занесите в таблицу. Сделайте выводы. При определении динамики роста отрезков колеоптилей постройте график зависимости скорости роста от времени при оптимальной концентрации ауксина. Твблнцл 5 Пророст, ОТ ~ ОНТ- родя Прврост в длину, мм данна отрсзков, мм К нцантрацмя аукснна, мт)л РАБОТА 3. ВЛИЯНИЕ ГИББЕРЕЛЛИНА НА АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ЗГРНОВКАХ ЗЛАКОВ Одной из наиболее изученных реакций растения на гиббереллин является индуусция гидролитических ферментов в семенах злаков.
В 1960 г. впервые было показано, что после набухания зерен злаков, через 12 — 24 ч, зародыш начинает выделять гиббереллины, ГК, которые диффундируют в алейроновый слой. Там они индуцируют синтез или активируют гидролитические ферменты (а-амилазу, РНКазу, кислую фосфатазу, протеазу и .др.) и стимулируют секрецию этих ферментов в эидосперм, где происходит распад запасных полимеров. Растворимые продукты распада поступают затем для питания зародыша. При уда.лении зародыша из семян индукции ферментов не наблюдается. Обработка таких беззародышевых семян экзогенным гиббереллином приводит к появлению ферментативной активности, Наиболее детально проанализирована индукция и-амилазы — фермента, гидролизирующего крахмал. С помощью метки и ингибиторов белкового синтеза показано, что а-амилаза под влиянием гиббереллина не просто переходит из неактивной формы в активную, а синтезируется заново.
Индукция ГК синтеза фермента с)е помо позволяет предположить, что механизм действия фитогормона связан с регуляцией экспрессии генов и образованием РНК. Действительно, ингибиторы синтеза РНК .подавляют синтез п-амилазы, индуцируемый ГК в алейроновых клетках. Опыты, которые проводили на бесклеточной системе синтеза белка с использованием мРНК, образованной подвлиянием ГК н качестве матрицы показали, что вновь синтезируемый белок"-а-амилаза Кроме действия на синтез белков и РНК ! К вызывает изменение ультраструктуры клеток алейроионого слоя. В присутствии эндогепного или экзогенного гиббереллнна происходит переваривание белкового материала в алейроновых зернах, быстрая активация синтеза фосфолипидов мембран, общего синтеза мембран, особенно шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭР), возрастает доля связанных с ЭР рибосом, стимулируется образование секреторных пузырьков.
Цель работы. Определить влияние ГКх на активность гидроЛитических ферментов в зерновых злаках. Объект исследования: верновкн пшевнцы, лчменя, овса. Подготовка растительного материала Зерновки разрезают на половинки и отделяют сегменты с зародышем от сегментов без зародыша. Те и другие части зерновки стерилизуют 5а(о-раствором гипохлорита кальция в течение 30 мин, отмывают 3 раза стерильной водой и замачивают в стерильной воде, Через 12 ч половинки зерновок с зародышем помещают в стерильные чашки Петри (в свежую дистиллированную воду), половинки зерповок без зародыша делят на две части, одну из которых помещают в воду, другую — в водный раствор ГКв в концентрации 25 мг(л. Раствор стерилизуют, пропуская через миллипоровый фильтр (0,22 мкм).
Все варианты ставят в термастат прн температуре 26'С. Время инкубации 24 и 48 ч. Реактивы н оборудование 50 мМ натрнйацетвтный б)фер рН 53 со держащий 20 мМ СаС!г, свежеоряготовленный 0,5%-й раствор крахмала в 50 нМ натряйнцетнтнон буфере, рН 5,3; подкисленный раствор !ТК! (90 мг 1г н 1,59 г К! растворяют в 400 мл 0,25 н. НС1); !%-й раствор агвра, содержвщяй !%-2 растворимого крахмала; !0%-й водный раствор 1гК! !прнгатовленяс сы. в Прнложеннн !); ступка с пестикам; цилиндр объемом 25 ыл; центрнфужные пробнркя; чашки Петри; стеклянные пробнркн; пипетки; терыостаты с температурой 70 н 37' С; водяная баня с температурой !00'С; центрнфуга типа НУД4-1; ФЭК нлти спектрофотометр.
Ход работы. Работу можно проводить в двух вариантах. Вариант 1. Пять половинок семян пшеницы взвешивают, растирают в охлажденной ступке на льду, постепенно прибавляя 1 0 мл натрийацетатного буфера, содержащего СаС!х. Гомогенат центрифугируют при 10000д в течение 10 мин. Супернатант сливают в колбу и помещают па 15 мин в термастат при 70'С, затем охлаждают в течение !О мин при 4'С.
Эта процедура подавляет активность Р-актилазы и мало влияет на активность а-амилазы, так как последняя более термоустойчива. После этой обработки супернатант центрифугируют вторично при 10 ОООАт в течение 10 мин. Активность а-амилазы определяют по гидролизу крахмала. 2 — 72 33 а!а Таблица 6 Лвананооть а-аннвааы Врачи аии сании, ч 'Варианты оиыта Без зародьппа НтО гк Н,О гк, С зародышем гк В иант 2. Приготавливают !о(п.й водный раствор агара и' 1%-й водный раствор агара, содержа!ций 1 (о растворимого к ахмала. Для этого добавляют агар и крахмал в воду, нагрер м' ° вают и кипятят до полного растворения агара. По 3 мл те лог раствора агара наливают в чашки Петри диаметром 3, мл.
Схема опыта Агар с крахмалом НтО ГКз. Н.О ГКз Агар без крахмала й! ч Нто ГКз 45' ч Н,О ГК После застывания агара на его поверхность поме!цают половинки семян пшеницы без зародышей, инкубираванные в воде или растворе ГКз в течение 24 или 48 ч. Сегменты зерновок ставят срезом на агар по 4 шт. на чашку. Чашки Петри переносят в термостат с температурой 26'С и оставляют там на 24 ч. После инкубации половички семян удаляют, а поверхность чашек заливают !0%-м раствором !зК! на 2 мин. Затем раствор сливают и чашки промывают водой. Выход амилазы из клеток вызывает гидролиз крахмала в среде, что определяют по присутствию чистых круглых зон вокруг сегментов зерновок.
В отсутствие амилазы чашки окрашены равномерно в синий цвет, В чашках без субстрата (агар без крахмала) окраска отсутствует. Для этого 2 мл раствора крахмала в натрийацетатном буфере разливают в контрольные и опытные пробирки, помещают их в термостат с температурой 37'С на 10 мин, затем прибавляют 0,5 мл иадосадочной жидкости в опытные пробирки и 0,5 мл натрийацетатного буфера в контрольные пробирки. Через 15 мин реакцию останавливают, прибавляя 2 мл подкисленного раствора 1зК1, добавляют 10 мл воды и определяют оптическую плотность растворов при А=620 пм. Оформление результатов. Рассчитайте активность фермента в величинах изменения оптической плотности за 1 мпн на 1 г сырой массы, Результаты оформите в таблицу. Сделайте выводы.
Оформление работы. Зарисуйте наблюдаемую в чашках картину после их обработки раствором йода. Сравните опытные и контрольные варианты. Сделайте выводы. ЗАДАЧА 2. МЕТОД КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ Растительный организм, существующий как целое, объединяет множество клеток. Интеграция клеток в организм обеспечивается благодаря действию сложных механизмов, включающих межклеточные взаимодействия и формирование единой системы метаболических потоков.
В то же время клетки растений потенциально способны к выполнению разнообразных программ дифференциации, представленных в их геноме. Эту особенность растительных клеток обозначают термином омнипотентносто, а реализацию одной клеткой программы зиготы называют тогипотенгностою. Тотипотентность клеток лежит в основе высокой пластичности морфогенетических процессов у растений, которая проявляется, в частности, при их вегетнтивном размножении.
Это свойство обнаруживается и в условиях зп з!!го. Различные варианты культивирования клеток и тканей растений на искусственных питательных средах представлены на рис. 4. В культуре зп и!1го можно поддерживать в жизнеспособном состоянии практически любой нзолированный орган растения или часть органа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
