А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 11
Текст из файла (страница 11)
При субкультиниронании суспензию клеток пересевакзт без фильтрования. Однако если необходимо получить более однородную культуру, фильтрование пронодят регулярно с использонанием сит с диаметром пор 30 и 90 мкм — «просеянная культура» (Огей1, Когпапнпе, 1981). После пересева колбу закрывают, подписывают и помещают на качалку. Суспензию клеток исходной культуры анализируют с помощью микроскопа.
Оформление работы. Опишите проделанную процедуру, обращая ннимание на характеристику каллуса (цвет, плотность, возраст и т. д.). Зарисуйте клетки моркови в суспензионной культуре. 43 РАБОТА 4 СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ Формирование зародышей из соматических клеток в условиях 1п уйго впервые наблюдали в суспензионной культуре клеток моркови Ф. Стюард с сотрудниками (8(етпагб е1 а1., 1958).
Такие зародыши при переносе на соответствующую среду развивались в целые растения. Данное явление получило название соматического эмбриогенеза, а зародыши, образующиеся таким путем,— змбриоидов, Этот процесс наглядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток. Соматический эмбриогенез включает стадии развития, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе; глобулы, сердца, торпеды, молодого проростка (рис.
7). В некоторых случаях эмбриоиды образуются непосредственно из клеток ткани, введенной в культуру, — это так называемый прямой змбриогенез. В других случаях происходит непрямой змбриогенез: вначале формируется каллус, а уже из него развиваются зародыши. Эмбриоиды образуются из Рнс. 7. Стадии эмбриогенеза: 1 — одиночных клеток, распологлоб ла, 11 — се ~ е, 111 — то пе а, рд". 'орпеда женных в основном на поверхЛг — молодой проростов ности каллуса. Окружающие вакуолизированные клетки могут выполнять по отношению к эмбриогенным клеткам функцию «ткани-няньки». В суспензионных культурах выделяют два основных этапа: сначала из одиночных клеток в результате многократных делений формируются компактные проэмбриогенные номплексы, затем из такого комплекса развивается один или несколько эмбриоидов. Клетки, дающие начало эмбриоидам, отличаются более плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным ядрышком, в них присутствуют крупные крахмальные гранулы и мелкие вакуоли.
Это клетки метаболически активны; они богаты белками и РНК. Потребность в гормонах на каждом из этапов эмбриогенеза различна. Образование проэмбриогенных комплексов происходит в присутствии ауксина, однако переход к формированию эмбриоидов этот гормон ингибирует. Поэтому на втором этапе соматического эмбриогенеза ауксин или исключают из сред или используют его в очень низких концентрациях. Предполагают, что прямой эмбриогенез в культуре происходит из клеток, которые уже детерминированы для эмбриогенного развития перед эксплантацией, т. е.
являются преэмбриогенно детерминированными. Поэтому для того чтобы произошла экспрессия эмбриогенеза, требуются только благоприятные условия. Непрямой эмбриогенез проходит путем реде- ггрминации (повторной детерминации) дифференцированных клеток, пролиферации каллуса и развития эмбриогенно детерминированного состояния. В этом случае необходимы гормоны как для индукции деления клеток, ~ак и для детерминации эмбриогенного состояния.
Планируя эксперимент по индукции соматического эмбриогенеза, важно правильно подобрать объект. Например, эмбриогенный каллус легче образуется из незрелых зародышей. Эмбриональные клетки, клетки молодых проростков, особенно из эпидермиса гипокотиля, представляют собой наиболее удобный материал для получения соматических змбриоидов. Эмбриогенез легко происходит в молодых культурах, эта способность клеток уменьшается по мере удлинения срока от начала культивирования.
У моркови эмбриоиды начинают образовываться через 4 — 6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза — 15 — 20 недель; 30 — 40-недельная культура часто теряет свой эмбриогенный потенциал. Цель работы. Получить соматические эмбриоиды в стадии торпед. Реактивы н оборудование: колбы со средой МС, ве содержащей гормонов; стерильные цилиндры объемом 50 — -100 мл; стерильные воронки; нейлоновые сита с дваметром пор 120 мнм; пипетка объемом 5 — 10 мл; шприц; камера для подсчета клеток; микроскоп; сосуд для слава надосадочной жидкости. Объект исследования: суспензнонная культура морновн, сорт Нянтсная.
Ход работы. Всю работу проводят в ламинар-боксе. Для получения эмбриоидов используют просеянную культуру, так как индукция эмбриогенеза возможна с клеточными агрегатами определенного размера, Подготавливают систему для филь'трования, состоящую из цилиндра, воронки и сита (см. описание в работе М 3) и фильтруют суспензию клеток. Обязательно обжечь на горелке горло и бок колоы, из которой будет перелита суспензия иа сито! После фильтрования цилиндр закрыва1оз крышкой и оставляют на 30 мин для осаждения клеток. Затем соединяют шприц с пипеткой (1О мл) и с его помощью осторожно отсасывают надосадочную жидкость, Необходимо удалить максимально возможное количество жидкости.
Эту. процедуру можно заменить центрифугпрованием суспензии. Поскольку эмбриогенез зависит не только от соотношения фитогормонов, но и от плотности посева, необходимо контролировать количество вносимых клеток и агрегатов. Осадок клеток разбавляют небольшим количеством среды, не содержащей гормоны, определяют число клеток и мелких агрегатов в этой суспензии (см. в Приложении о подсчете числа клеток) и пипеткой пересевают клетки в колбу со свежей средой, не содержащей гормоны, так, чтобы концентрация клеток в колбе была 10« клеток на 1 мл.
Колбу закрывают, подписывают и помещают на качалку с температурой 20'С, скоростью качаний 130 об(мин, освещением 700 лк. Через 14 сут анализируют суспензию, определяя с помощью лупы стадии эмбриогенеза. Оформление работы. Опишите проделанную процедуру. Зарисуйте эмбриоиды на различных стадиях развития.
РАЬОТА ьЕ АНДРОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ ПЬ1ЛЬНИКОВ И ПОЛУЧЕНИЕ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИИ ТАБАКА В УСЛОВИЯХ 1Ы У!ТРО Покрытосемеиные растения на пр<ияжении своеп> жизненного цикла реализуют две неравные по продолжительности программы развития: спорофитную, занимающую большую часть их жизни (диплофаза), и короткую гамстофигную (гаплофаза). В некоторых случаях возможно переключение с гаметофитного пути развития на спорофитный. Сравнительно. легко такое переключение может быть произведено в условиях культивирования (п У!!го пыльников илн микроспор (андрогенез) с помощью факторов внешней среды, в том числе концентрации гормонов. В результате изменения программы развития гаплоидной микроспоры прекращается формирование пыльцевого зерна (мужского гаметофита), идут процессы пролиферации клеток, приводящие к образованию либо эмбриоида, который разовьется в гаплоидное растение — спорофит, либо каллуса.
В соответствии с этим различают два пути регенерации гаплоидов >и уйго — прямой и непрямой. Явление андрогенеза в культуре пыльников впервые описали в середине 60-х годов индийские ученые Оцйа, Ма)>ез(>ч>аг!. За прошедшее время разработаны методы культивирования пыльников и микроспор более чем у 170 видов растений, в числе которых немало хозяйственно ценных культур.
Интерес исследователей к данной проблеме обусловлен се значимостью для решения задач практической селекции и генетики. Получая гомо.иготные диплоидные растения на основе гаплоидных регенерантов (>ак называемых «пыльцевых гаплоилов»), удается в 2 — 3 раза сократить сроки выведении новых сортов риса, табака, пшеницы и т. и. Вместе с тем культуры пыльников нли изолированных микроспор — удобный обьект для исследования фундаментальных проблем физиологии развития, генетики и биохимии растений.
Для успешной индукции андрогенеза !п уйго (переключения развития с гаметофитной программы на спорофитную) важное значение имеют условия выращивания растения-донора и его генотип, состояние пыльников в момент инокуляции и условия их культивирования. Временной интервал в развитии микроспор, оптимальный для индукции анлрогенеза,— критический агап — у большинства видов начинается накануне митоза н завершается вскоре после него.
Отбор материала для культивирования существенно упрощается, если ориентировочную оценку стадии развития микроспор проводить по внешним признакам, например, взяв за основу длину бутона илн соотношение длин чашелистиков и лепестков. В этом случае используют предварительно составленную шкалу соответствия стадии развития микроспор и изменения выбранного параметра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
