А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В изолированных семядолях в темноте происходит быстрое истощение эндогенных гормонов. Через 24 ч семядоли переносят на исследуемые растворы и помещают в фототермокамеру при температуре 28'С и круглосуточном освещении на 48 ч. Исследуемые растворы: контроль - — дистиллированная вода; АБК— 1 мг)л; 6-БАП вЂ” 10 мг)л; 6-БАП вЂ” 100 мг)л. ОТ!ЫТ !. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОСТА СегКТЯДОЛЕЙ Развитие семядолей представляет собой процесс, в течение :которого одновременно идет новообразование структурных элементов клетки н расходование ее запасных веществ.
Сухая масса при этом практически не меняется. В связи с этим рост изолированных семядолей тыквы удобно определять по изменению их сырой массы. Ход работы. Взвешивают на технических весах все семядолн каждого варианта, подсчитывают их количество и определяют среднюю массу каждой семядолп. Опыт з. ОпРеделе!чие коли'еествА хлОРОФилл ! в семядолях Ход работы.
Навеску семядолей (200 мг) растирают в ступ.ке с небольшим количеством песка н СаСОз (на кончике скальпеля), экстрагнруют пигменты раствором зтанола, фильтруют экстракт через стеклянный фильтр н доводят объем в мерной колбе до 25 мл. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре ) =662 и 642 нм. Количество хлорофилла (а и Ь) определяют по формуле Са+ь=7,12ЕЕАА+16,8Е44э, мг/л.
Пересчитывают количество хлорофилла на 1 г сырой массы. опыт х опгеделгние пгоницАемости клеточных мемеРАН Ход работы. Сверлом вырезают 60 дисков нз семядолей каждого варианта, помещают по десять дисков в бюкс, который закрывают марлей. Последнюю закрепляют резинкой и ставят бюксы под холодную водопроводную воду на 15 мин, чтобы отмыть содержимое разрушенных клеток. После этого бюксы с дисками промывают 3 раза дистиллированной водой и переворачивают на чистую фильтровальную бумагу для удаления остатков воды. Затем с них снимают марлю, наливают по 10 мл дистиллированной воды, закрывают крышками и помещают три бюкса в термостат при температуре 25'С на ! ч.
Для определения общего количества электролитов в дисках три других бюкса помещают в кипящую водяную баню на 15 мин. После инкубации содержимое бюксов фильтруют через марлю в чистые бюксы, остужают фильтраты до комнатной температуры и определяют их электропроводность кондуктометрическим методом. Рассчитывают выход электролитов в каждом варианте в процентах от общего их количества. Опыт А Опиеделение Активности мллик-энзимА Малик-энзим осуществляет декарбоксилирование малата в присутствие НАДФ и ионов Ми'" с образованием пирувага и восстановленного НАДФ: НАДФ, Мя'+ Мал ат-4 — — ь Пируват + СОг.
Фермент играет важную роль в регуляции уровня малата и обеспечении НАДФ Н многих биосннтетнческих процессов в клетке. Активность фермента не обнаруживают в сухих семенах, она появляется прн их прорастании. Ход работы. Взвешивают по пять семядолей каждого варианта, растирают их в ступке с небольшим количеством песка, гомогенизируют в 5 мл раствора трис-НС! буфера с ДТТ.
Работу проводят в холодной камере при температуре 2 — 4' С. Гомогенат центрифугируют 30 мин при 20000 д; полученный супернатант используют для определения ферментативной ак- тивности, Для этого к 0,2 мл реакционной смеси приливают 0,1 мл раствора фермента. Реакцию начинают прибавлением 2,5 мМ малата, В контрольную кювету помещают те же реактивы, кроме малата. Измеряют оптическую плотность раствора последовательно в одних и тех же кюветах через каждую минуту в течение 5 — 7 мни при 5=340 нм, За единицу активности фермента принимают количество фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности раствора иа 0,01 за 1 мин. За удельную ферментативную активность принимают количество фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности раствора на 0,01 за 1 мин на 1 мг белка.
Определение количества белка см, выше (рэзд. 1, задача 1, работа 3). Активность фермента рассчитывают для каждого варианта. Опыт а ОпРеделение Активности АмилАЗ Ход работы. Навеску (1 г) семядолей тыквы измельчают ~г растирают в охлажденной ступке на льду. К гомогенату приливают 40 мл фосфатного буфера н центрифугнруют 15 мин при 10000д или фильтруют через плотный складчатый фильтр.
Надосадочиую жидкость илн фильтрат сливают в чистую пробирку и используют для определения активности фермента. В результате действия (1-амилазы на крахмал образуются главным образом мальтоза и незначительное количество высокомолекулярных декстранов. Последние в дальнейшем гидролизуются а-амилазой, Мальтоза при взаимодействии с 3, 5-динитросалициловой кислотой (ДНС) дает окраску, которая находится в прямой зависимости от содержания сахара, Оптимальная температура действия фермента 37'С, поэтому исследуемую вытяжку и раствор крахмала предварительно термостатируют при этой температуре. Для определения активности фермента проводят следующие варианты подготовки.
1. Контроль на реактивы: 0,5 мл ! % -го раствора крахмала; 0,5 мл 0,005 М фосфатного буфера; 1 мл ДНС. 2. Контроль; 0,5 мл буфера; 0,5 мл вытяжки; 1 мл ДНС. 3. Опыт: 0,5 мл 1%-го раствора крахмала; 0,5 мл вытяжки; смесь перемешивают и помещают в термостат при 37'С на 5 мин, затем сразу приливают 1 мл ДНС. Все пробирки нагревают па кипящей водяной бане 5 мнн, затем объем доводят до 10 мл водой. Оптическую плотность определяют при 5=535 нм. Количество мальтозы вычисляют по калибровочной кривой.
Активность фермента выражают в мнллиграммах мальтозы на 1 г сырой массы за 1 мин. Оформление работы. Данные всех опытов представьте в виде сводной таблицы. Сделайте выводы. 29 Таблица 4 а-БАп, Азк, 100 м»1л ~ 1 мг,л Хоп»роль 1н,о1 а-БАп 1О мг1Л Сырая масса 1 семя- доли, г Количество хлорофил- ла, мг/г сырой массы Проницаемость клеточ- ных меибран, Чо от пол- ного выхода электроли- тов Активность малик-эи- аима, ед.
на 1 г сырой массы или 1 мг белка Актнвиость амилаэ, мг малътозы иа 1 г сырой массы за 1 мии РАБОТА 2. ВЛИЯНИЕ АУКСИНОВ НА РОСТ ОТРЕЗКОВ КОЛЕОПТИЛЕРГ ЗЛАКОВ 30 Среди многочисленных эффектов, которые вызывают ауксины, наиболее изученным является их действие на рост растяжением у отрезков колеоптилей или стеблей, что и используют как чувствительный биотест на этот гормон. Установлено, что ауксины вызывают выделение ионов Н+ из клетки, гиперполяризацию мембранного потенциала, усиление поглощения Кг, повышение рН цитоплазмы, накопление малата или других органических кислот. Во время растяжения в клетке появляется центральная вакуоль, занимающая большую часть ее объема. Образование вакуоли связано с увеличением поступления воды прн понижении водного потенциала клетки, при этом осмотический потенциал поддерживается на постоянном уровне в результате гидролиза полимеров и накопления в клетке осмотически активных веществ.
Потенциал давления снижается, так как под влиянием ауксина увеличивается растяжимость клеточной стенки. Рнд исследователей объясняют действие ауксина на рост подкислением клеточных стенок. Это приводит к разрушению кислотолабнльных связей компонентов стенки и активации кислых гидролитических ферментов, также разрыхляющнх клеточнун1 стенку. Такое представление подтверждают факты выброса Но в окружающую среду под влиянием аукспна н существования так называемого «кислого роста». Последний представляет собой рост отрезков растений в кислом буфере.
Однако имеется ряд различий между ростом растяжением, индуцируемым ауксином и кислыми средами. Прежде всего различна кннетика роста (рис. 3). Имеются и другие отличия этих двух типов роста. Ауксинзависимый рост связан с синтезом РНК ч белков. Ингибиторы синтеза этих веществ устраняют действие ауксина на рост клеток. Особое значение имеет продолжительность лат-периода действия ауксина на синтез РНК и белка. лв В ряде работ показано, что образование определенных мРНК происходит в течение Рис. 3.
Влиявие иидалилуксусной кисло- !О мнн после действия аук- ты (1) и цигратнофосфатиого буфера сина, т. е. этот процесс про- (2) иа скорость роста отрезков колеонтекает в течение лат-фазы гилей (но И. Е. !Паровой, В. В. Полевому, 1935): ! — концентрация 10 мама, УксининДУЦИРУемого Роста. 2 — концентрация 1,5 ммоль!л, рН 3,2 Таким образом подтверждается точка зрения, что первичным действием ауксина может быть активация генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
