А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Эффективность индукции анлрогенеза можно существенно повысить, подвергая микроспоры накануне культивирования стрессорному воздействию. Наиболее распространенный способ — обработка бутонов или соцветий холодом Иногда снижают температуру выращивания растений, изменяя одновременно световой режим. Условия обработки определяют экспериментально. Питательнь<е среды для культур пыльников в болыпинстве случаев составляют на основе прописей Мурасиге — Скуга (среда МС), Линсмайера — Скуга, Уайта или Нич (Т. Мпгас(>(де, Р.
Зйоод, Е. М. 1 !паша(ег, Р)>. К. %Ы!е, 3. Р. %(зс(>, С. К1!зс(>), включая в качестве добавок различные соединения (гармонь>. аминокислоты, витамины) или экстракты (например, картофельный). Состав и концентрации добавок, так же как и концентрация сахаров, видоспецифичны. Культивирование пыльников проводят на жидких, полу- твердых и комбинированных средах — двуслойных (нижний слой образован агаризованной средой, часто с добавлением активированного угля, верхний слой — жидкий). Хорошие результаты дает метод плавающих пыльников Сандерленда: пыльники, помещенные на жидкую или комбинированную срелу, через некоторое.время раскрываются, и микроспоры высыпаются наружу, т.
е. фактически микроспоры культивируются в присутствии пыльников что положительно сказывается на ранних этапах индукции андрогенеза (Заметим, что состав среды для культур изолированных микроспор существенно сложнее, чем для культур пыльников.) Важное значение при работе с культурами пыльников и микроспор имеют также физические условия инкубации. температура, освещенность, число пыльников (или микроспор), приходящееся на объем питательной среды, и т.
и. формирование эмбриоида из микроспоры длится от 3 ло 1О недель в зависимости от вида растения. В результате последовательных делений эмбриогеннои клетки, происходяпвих внутри оболочки пыльцевого зерна, формируется шарик из множества мелких клеток (размеры клеток у пыльцевого эмбриоида табака и зиготического зародыша примерно одинаковы). Наконец экзина (оболочка пыльцевого зерна), окружающая эм- 47 бриоид, разрывается, н он высвобождается. После этого средний размер клеток начинает увеличиваться. Далее эмбрионд развивается вполне аналогично зиготическому зародышу. Дифференцируются корневой и стеблевой концы, развиваются семядоли, образуются маленькие проростки, которые после ггеренесения на свет зеленеют.
Зги растеньица пересаживают на агаризованную сроду для укоренения, где у них развиваются первые листья. Когда растения достигают 3 — 5 см, их можно переносить в горшки с землей. Иногда в культуре пыльников образуются нсгаплоидные растения, которые возникают по разным причинаьг: из-за слияния ядер во время первых 'делений микроспоры, из-за образования регснерантов из негаплоидных клеток стенки пыльника и т. д. Поэтому идентификация гаплоидов-. важный н необходимый этап работы. С этой целью используют различные методы: подсчитывают число хромосом в делящихся клетках кончика корня число хромоцентров, приходящееся на ядро в клетках листа, число ядрышек в их ядрах, число пластид в замыкающих клетках устьиц. Последний метод отличается наибольшей простотой.
Он основан на том, что у гаплоидов число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (которые очень легко идентифицировать) почти в 2 раза меньше, чем у диплоидов. Гаплоиды, предназначенные для селекционной работы, приходится диплоидизировать и таким образом получать гомозиготные диплоиды (их часто называют дигаплоидажи). С этой целью используют колхицинирование гаплоидиых мери- стем (колхицин останавливает митоз в метафазе, инактнвируя механизм веретена) или получают каллус в культуре ткани гаплоидного растения и после его спонтанной или нндуцированной полиплоидизации регенерируют днплоиды.
Цель работы. Индуцировать андрогенез в культуре пыльников табака. Получить гаплоиды и идентифицировать их. Реактивы и оборудование: флаконы с питзтельвов средой (см. Прггложение 1); 70еге-й раствор зтяволя; 0,0!еге-гт раствор тиомерсзлв для стерилиззпии бутонов; хрвситель зпетоязрмия (см. Прилогяевве 1]; стерильная диствллировявявя водя; пиипеты; препзровяльиые иглы; лезвие бритвы; стаканы для стерилиззпии материала; предметные и покровиые стекла; фольга для закрывания флаконов и для выделения пыльников; ламивврбокс, термастат яв 26'С, микроскоп, спиртовка.
Объект исследования: бутоны табака гггсоггаоа гаЬасигп, сорт Сзмгув, собрзииые зз 7 сут до начала опыта и выдержвввые в холодильвике при температуре 4 — 6* С. Ход работы. Работа состоит из трех этапов, 1. Установление соответствия между длиной бутона и стадией развития пыльников, Отбор бутонов, в которых пыльники находятся на критическом этапе развития: накануне, во время и непосредственно после митоза микроспоры. Длину бутона измеряют в миллиметрах с помощью линейки. Затем определяют стадию развития микроспор в данном бутоне на временном препарате после окраски ацетокармином. Окрашивание проводят следующим образом: содержимое пыльника «вытряхивают» с помощью препаровальных нгл в каплю ацетокармипа на предметное стекло.
Обрывки пыльни га удаляют пинцетом. Препарат накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают на пламени спиртовки. С помощью микроскопа определяют стадию развития микроспор. Длину исследуемого бутона заносят в соответствующую графу табл. 7. Определяют диапазон оптимальных значений длины бутона.
Отбирают бутоны для работы. 2 Стерилизация поверхности бутонов и имокуляция ггыльников на питательную среду. В ламинар-боксе готовят пять стерильных стаканов; наливают в первый из ннх раствор этанола, во второй — раствор тиомерсала, в три остальных —. стерильную дистиллированную воду. Стерилизуют бутоны (1 мин в растворе этанола и 7 мин в растворе тиомерсала) и отмывают их в трех порциях воды. Вынув бутоны на стерильную поверхность фолы и, стерильными препаровальными гггла~ми разрывают покровы и пинцетом переносят пыльники во флакон со стерильной питательной средой. Закрывают флакон новой стерильной фольгой и надписывают.
Аналогичным образом высаживают пыльники в остальные флаконы; по два бутона на флакон. Стерильную фольгу для препариронания бутонов нужно каждый раз брать новую. Флаконы с пыльниками ставят в термостат и инкубируют при 25'С в темноте в течение 8 недель. По прошествии этого времеви анализируют результаты опыта и заносят их в табл. 8. Суммируют данные, полученные всей группой, и оценивают эффективность индукции андрогенеза (процент флаконов, в которых прошел эмбриогенез илн каллусогенез).
3, Определение илоидности растений посредство,и подсчета числа хлороп.гастов в зплгыкаюгцих клетках устьиц Необходимо определить плоидность двух листьев, из которых один гаплоидный, другой диплоидный. Готовят предметное стекло с каплей воды на нем. С помощью лезвия бритвы снимают с нижней поверхности листа кусочек эпидермиса. Аккуратно переносят эту пленку на поверхность капли и расправляют. Накрывают покровным стекггом и с помощью микроскопа (увеличение Х40) подсчитывают число хлоропластов в замыкающих клетках десяти устьиц. Результаты заносят в таол.
9. Подсчитывают средние значения числа хлоропластов для каждого из листьев и сравнивают их между собой. Оформление работы. Предстаньте результаты в виде таблиц. Сделайте выводы. 48 49 Таблица 7 даяна бутона, яз Стадия разазпяя Раздел П1 ФОТОСИ НТЕЗ органических веществ раэнергии света. Суммарное Таблица 8 Рсзуаьтат' М. алазань Таблица 9 йт СОз+НзΠ— -+.
(СНзО) +Оз. Чясзо злоросзастоа яа уса ьнцс ЬЬ язясрсяяя Лясс Тиз! ( Ласт % 2 РЕКОМЕТГДУЕМА77 ЛИТЕРАТУРА 50 Тетрзды микроспор (завершение мейоза) Одноядерная микросппрл с ядром в центре Критический зтвп: одноядерная мнкрпспора накануне деления деление микроспоры ранняя двухъядернзя микросппра Двухклеточное пыльцевпе зерно с интенсивно окрашенной цитоплззмой, заполненной запасными веществами ' р — растеньидв; к . — каллус; о — отсутствие признаков андрогенеза. Биотехнология растений: культура клеток, М., 1989. Вятсике Р.
Г. Экспериментальный морфотснез и дифференциация в куль- туре клеток растений 17 Зб-е Тимирязевское чтение, Мо 1975. Гзлстсн А., Девис П., Саттер Р. Жизнь зеленого растения. М., 1983 Дерфлинг К. Гормоны растений. М., 1985. Клеточная инженерил 1Р. Г. Бутенко, М. В. Гусев, Л. Ф. Киркнн н др. М., 1987. Кулаева О, Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
