А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 16
Текст из файла (страница 16)
В качестве контроля для уравнивания мутности непрозрачного листа используют пергаментную или фильтровальную бумагу. Кюветы ставят в специальные прорези кюветного отделения и записывают спектр поглощения. Оформление работы. См. равд. 1, задача !. Отметьте различия в положении максимума поглощения пигментов в ацетоне (этиловом спирте) и в живом листе. Рассчитайте содержание пигментов по спектрам поглощения, используя формулы, приведенные в работе 1 данной задачи. РАБОТА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПИГМЕНТНЫХ СИСТЕМ ЦИАНОБАКТЕРИИ АЛАВАЕ1УА УАкТАВ!ЕТБ Цель работы.
Экстрагнровать хлорофилл и фикобилины из клеток А. Оагсаб111н. Сравнить спектры поглощения пигментов 'и Уеуо в клетках А. Оагьа12111з и в растворах. Реактивы и оборудование: см. работу 1 данной задачи; жидкий азот; центрифуга ЦЛС-З. Объект исследовании; культура клеток А. еагМЬ11М различного возраста. Ход работы. Культуру клеток А. Оаг1аб111з разливают в центрифужные пробирки, клетки осаждают центрифугировапием в течение 5 мин при 4000 об/мигь Осадок из одной центрифужной пробирки суспендируют в небольшом объеме (3— 5 мл) культуральной жидкости и используют для снятия спектра поглощения пигментов ш ч(чо.
Оставшиеся осажденные клетки переносят в фарфоровую ступку и использу1от для извлечения пигментов. Для этого клетки в ступке заливают жидким азотом. Затем к ним добавляют немного кварцевого песка и СаСОз и растирают, добавляя небольшими порциями (пс 3 — 5 мл) 100згр-й раствор ацетона. Г1олу генную вытяжку сливают по палочке на стеклянный фильтр № 3, вставленный в колбу Бунзена. Внутрь колбы помещают мерную пробирку. Отсасывают жидкость при помощи ацетона, растирают, снова сливают на фильтр н отсасывают жидкость. Эту операцию повторяют несколько раз, пока раствор, стекающий с фильтра, не будет абсолютно беспветен. Вытяжку из проби~рки переливают в мерную колбу объемом 25 мл и доводят ацетоном объем вытяжки до метки. Ацетоновая вытяжка содержит зеленый пигмент цианобактерий— хлорофилл а.
Осадок голубого цвета, оставшийся на фильтре, заливают водой, настаивают при помешивании стеклянной палочкой. Водный экстракт отсасыва«от с помощью водоструйного насоса в пробирку, помещенную в колбу Бунзена. Промывают осадок несколько раз водой до полного удаления фикобилинов (до обесцвечивания фильтрата) и объединяют водные экстракты. Экстракт содержит водорастворимые пигменты цианобактерий — 9икабилиньг (фикоцианин и аллофикоциапин). Спектры поглощения суспензии клеток, ацетонового экстракта и водного экстракта регистр~руют на спектрофотометре.
Порядок работы на регистрирующих спектрофотометрах описан в Приложении П. Оформление результатов. Проведите расчет содержанияпигмептов по формулам, приведенным в работе 1 данной задачи. РАБОТА 5. СРАВНЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ПИГМЕНТОВ ЭУКАРИОТНЫХ И ПРОКАРИОТНЫХ ФОТОТРОФОВ Пигментный аппарат фотосинтезнруюгцих организмов мажет быть качественно охарактеризован с использованием метода яр алга тог ра фин. Разделение смеси пигментов на отдельные компоненты проводится с помощью хроматографии на различных носителяхадсорбептах (бумага, сахароза, силикагель, силуфол и др.).
Чтобы пигменты разделились на сорбентах, используют систему пеполярных растворителей с примесью определенного количества полярного растворителя. Пигменты, обладая неодинаковой растворимостью в данном растворителе и разной способностью к адсорбции, передвигаются по мере движении ра- створителя с различной скоростью и располагаются на а дсорбенте отдельными зонами. Чем больше растворимость пиг, ента в р створителе и чем хуже он адсорбируется данным ада игменсорбентом, тем быстрее этот пигмент будет передвигаться и тем дальше от старта будет располагаться зона этого пигмента.
Цель работы. Разделить смесь пигментов с помощью хроматографии и проследить, какие сходства и различия имеются в пигментном аппарате у разных групп фотографов. Реактивы и оборудование: 100'$-й раствор ацетона; 96«!«-й раствор этилового спирта; пегролейный эфир; этиловый эфир; гексан; бензин, М СО (Са Ор): 1«1а«БО« безводный; кварцевый песок; фарфоровые ступки с пестиками; скальпель; ножницы; пинцет; стеклянные палочки; колба Бунзена со стеклянным фальтром 4«Ь 3; мерные пробирки объемом 10 мл; ц . др ъемом 25 мл; коннчсскне пробирки; центрифужные пробирки; нанн объ . пппеткп объемом 2 и 5 мл; капилляры; силуфоловые пластинки; х, гг афячсскне р ф камеры; фольга; весы торснонные; спекгрофотометр; цснгрнф га ЦЛС-3 жидкий азот.
фуг Объект исследования: листья высших растений (гороха, пшеницы н др) н культура клеток цианобактернн. Хад работы. Работа состоит из двух этапов. 1. Получение вытяжки пигментов Для получения вытяжки пигментов из высших растений навеску листьев, равную 0,5 г, тщательно растирают в сухой фарфоровой ступке с 1 — 2 г безводного ~а Ягд 04 и неоольшим количеством СаСОз до сухого зеленого порошка. Измельченный растительный материал переносят на стеклянный фильтр № 3 и 4«астаивают в течение 5 мин с 3— 5 мл растворителя (смесь ацетона и этилового спирта в отно«пенни 3; 1).
Небольшимп порциями растворителя из растиби тельного порошка на фильтре вымывают все пигменты в проирку, вставленную в колбу Бунзена. Для окончательной экстракции пигментов порошок промывают порцией этилового эфира и общий объем экстракта в пробирке доводят раствоРителем до 10 мл. Экстракт содержит сумму зеленых и желтых пигментов. Для экстракции пигментов из цианобактерии клетки предварительно осаждают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 мин. Затем их переносят в фарфоровую ступку и несколько раз замораживают жидким азотом и оттаивают. П игот овленные таким образам клетки тщательно растирают с ри1 — 2 — 2 г безводного )ъаз304 и небольшим количеством СаСО, г пе ренасят на стеклянный фильтр и производят экстракцию о. з, пигментов описанным выше способом. 2. Хроматагрпфичевног разделение пигментов.
Разделение пигментов производят на пластинках силуфола размером 5Х тй 5 см. Эти пластинки предназначены для тонкослайной хроХ15 Матографии. Они изготовлены из алюминиевой фольги, на кото рую в качестве сорбента нанесен силикагель; связывающим веществом здесь является крахмал. Чтобы предотвратить окисление хлорофилла во время,разгонки пигментов, пластинку предварительно обрабатывают 10 ' й( раствором аскорбиновой кислоты.
66 67 ~а пластинку силуфола с помощью капилляра наносят вытяжку пигментов (0,05 — 0,15 мл) полосой 1,5 см на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. В процессе нанесения вытяжки пластинку подсушивают струей воздуха. После нанесенки нужного объема вытяжки пластинку подсушивают до полного испарения растворителя и помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей следующего состава. бензин, ацетон, петролейный эфир, гексан в объемном соотношении 10:!О:3:10. Вытяжку пигментов из высших растений и цианобактерий наносят па одну пластинку. -1-4 68 Рис. 1О. Рзспределеиие отдельных зои пигмеитов высших растений (1) и пиаиобвктсрий (!!) при разделении ив силуфоле: ! — ()-кзротпи, 2 — эхииеиои, 8— феофитии, 1 — мииорпые ксантофиллы, б — хлерофилл а, б — хлорофилл Ь, 7 — лютсив + зезксаитип, 8 — витерзксзитии, Р— виелзксвитии, 10 — веоксавтив, !1 — миксосвитофилл, 12— старт Разгопку проводят в сосудах с плотно закрытой крышкой, затемненных черной бумагой.
После того как фронт растворителя поднимется вверх (не доходя 2 см до края пластинки), хроматограмму вынимают и высушивают под струей возд)'ха. Идентифицируют пигментные зоны (рис. 10), Оформление работы. Полученную хроматограмму наклейте в тетр адь, Отметьте зоны пигментов. Опишите различия пигментных систем двух исследованных групп фотосинтезирующих организмов. Для подробного оформления задачи см. равд.
1, задача 1. РАБОТА 6. РАЗДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ КАРОТИНОИДОВ ЗЕЛЕНОГО ЛИСТА Цель работы. Отделить каротнноиды от хлорофиллов и определить их содержание в зеленых листьях. Реактивы и оборудование: те же, что в работе 5 двиной задачи. Объект исследован ия: листья высших растений (ивпример, примулы). Ход работы. Для решения задачи надо получить вытяжку пигментов, отделить каротин, лютеин и виолаксантин, а также определить концентрацию каротиноидов.
1. Получение вьстяэ!гни пигментов. Методика получения вытяжкИ иигментов из листьев растений описана в работе 4 данной задачи. Смесь для экстракции пигментов содержит спирт и ацетон в отношении 1: 3. 2 Хроматаграфическог разделение пигментов Разделение пигментов производят на силуфоловых пластинках размером 15Х15 см.
Пигменты наносят капилляром по всей ширине пластинки, отступая 2 см от нижнего края пластинки и по 1 см от боковых краев. Объем наносимой вытяжки: 0,5 — 0,8 мл. После тщательного подсушивания пластинки в токе воздуха проводят хроматографнческое разделение пигментов. Условия проведения разгонки пигментов те же, что в работе 4 данной задачи. Порядок расположения отдельных зон пигментов представлеп на рис.
11, Для количественного опре- деления каротиноидов необходимо получить две-три хроматограммы. 3 Определение концентрации каротиноидов. Окрашенные зоны, соответствующие каротину и ксантофиллам (неоксаптин, виолаксантин, аптеро- Е222с312Г~~ 1 ксаптнн, лютеин+зеаксантин), г соскабливают скальпелем с 2 — 3 хроматограмм, зоны одноименных пигментов соединяют и помещают в пробирки с притертыми пробками.
Пигменты элюируют следующими растворителями: каротин — петролинейиым эфиром, ксантофил- Рис. ! 1. Распределение пигментов из хромвтограмме: 1 — ()-квротип, лы — этанолом. 2 — феофитии, 8 — хлорофилл а, Элюцию пРоизводлт пРи 4 хлерефилч б б лштеии встряхивании проб, затем элю- -1- зевксвптии, б — виолзксзитип, ат фильтруют через бумажный 7 — иеоксзитии, 8 — старт фильтр в мерные пробирки с притертой пробкой, фичьтр несколько раз промывают соответ- ствующим растворителем и объем доводят до 3 мл. Пробы промеряют на спектрофотометре: каротип — при 452 нм, лютеин — 445, виолаксантин — 442, неоксантин — при 438 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
