А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 18
Текст из файла (страница 18)
После выключения света в световые пробы сразу же добавляют 1 ! мл ТХУ и 2 мл СНзСООА)а, затем те же реактивы приливают в темновые варианты. Пробы фильтруют через двойкою 2 бумагкные фильтры. Полученные 7 фильтраты промеряют на спектрофотометре или Спеколе при А=420 нм (контроль — вода). 1 3. Определение хлорофилла и ='р=-':% суспензии хлоропластов. В мерную пробирку вносят 1 мл суспензии, 1 мл дистиллироВанной воды и' 5- 100о(о-и РаствоРом ацетона доводЯт объем до 10 мл. Раствор хорошо перемешивают и фильтруют в коническую пробирку через стеклянный фильтр № 2 или № 3. Полученный фильтрат промеряют на спектрофотометре или РИС.
13. УСтапапиа ДЛЯ ОПРЕДЕСпеколе при А=852 нм (конт оль — ленив фотоснитетического фа- р тофосфорнлнроваиия: ! — мо- 80о)о-й раствор ацетона). Измерен- тор, 2 — вращающийся диск с ную оптическую плотность раствора колбами, э — крнсталлизатор с ))бзз (контроль — 80')о-й раствор водой, 4 — штатив, б — защнтацетона). ИзмеРеннУю оптическУю лампа накаливания (500 нт) плотность раствора !!без использ)'ют 7 — термометр для расчета содержания хлорофилла в суспензии хлоропластов. 1 мл суспензиихлоропластов содержит 0,29 1узбз мг хлорофилла (расчет коэффициента 0,29 приведен в задаче 4 данного раздела).
4. Расчет скорости реакции Хилла, Активность переноса электронов в ЭТЦ фотосинтеза выражают в мкмолях КзГе(С)л))а мг-' хлорофилла ч-'. Формула для расчета активности реакции Хилла: (04ао а и — Осао * )60.8 1,04.5. 0,290ыа Оформление работы. См. равд. 1, задача 1. Полученные результаты внесите в табл. 12. Сделайте выводы о влиянии ЛДФ яа скорость потока электронов в ЭТЦ. Таблица 12 Лк а ива ость реакции Хилла, маколь К гсгснгмме — ' кло- рофилла 1 в-е Ошив скак плоскость филь Оа сов аи, Номе: кс лбы Варваиты опыта !таво томи — Оьм свае 76 РАБОТА 2.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ХЛОРОПЛАСТОВ ПО СКОРОСТИ ВЫДЕЛШ!ИЯ КИСЛОРОДА (ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ) Фотоиндуцирусмый перенос электронов в ЭТЦ сопряжен с выделением кислорода в ФСП (см. рис. 12). Поэтому скорость выделения кислорода изолированными хлоропластами на свету в присутствии экзогенного акцептора электронов может быть использована для характеристики фотохимической активности хлоропластов.
Цель работы. Определить фотохимическую активность хлоропластов по скорости выделения кислорода в различных условиях эксперимента. Реактивы и оборудование: среда выделепця (0,3 М раствор !ЧзС! в 0,06 М фасфлтпом буфере, рН 6,9); 35 мМ раствор МяС!а; 7,5 мМ раствор КаГе(СК)а 30 мМ раствор АДФ; рН 7,8; 35 !Π— ' М раствор 1ЧН40; 35 !Π— 4 М раствор дпуропл; 25.!О-' М раствор гпдроксплампиа, !00'/о-й и 80о/о-й РаствоРы ацетона; фаРфоРоваЯ стУпка с пеетпком; цептРпйгУжные пробирки — 4 штл мерный цилиндр объемом 25 к 50 мл — 2 штг мерная пробирка объемом !О мл — ! шт; коническая пробирка объемом !О мл— ! шт; пипеткп объемом 1, 2, 5 к 10 мл; колба Бунзена со стеклянным фильтром № 3; шпрпцы объемом ! мл — 4 штл тефлоноеый гомогепкзлтор; полотпо, стеклянные палочки; темпзв банка; лед; центрпфутл ПЛС-3; технпческпе весы; епектрофотометр; полярографпческзя установка с термостаткруемой ячейкой. Объект исследования: листья горохе.
Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Выделение хлороп гаагов Метод выделения хлоропластов описан в работе 1 данной задачи. 2. Определение скорости выделения кислорода хлоропластами полярографическим методом, Теория метода изложена в равд. 1гг. Определение полярографнческнм методом проводят на специальной установке.
Блок-схема установки (см. рис. 30) и порядок работы на ней представлены в Приложении П. Реакционную смесь готовят непосредственно в полярогра- фической ячейке. Объем ячейки 3,5 мл. В ячейку вносят: 1 мл ((лГе(СМ)б (конечная концентрация в реакционной смеси 1 б мМ), 0,1 мл МдС!е (конечная концентрация в реакционной см меси ! мМ), 2,4 мл суспепзии хлоропластов. После заполненн ня ячейки плавно, ввннчивающим движением опускают крышку, следя за тем, чтобы под крышкой не осталось пузырька во~духа. 13ключают движение диаграммной ленты самописца и в течение нескольких минут (в темноте) ведут запись исходного содержания кислорода в реакционной смеси. После установления прямой линии включают свет (отметить па диаграмме моМегп включения света) и регистриругот изменения содержания кислорода в реакционной смеси в тсченни 2 — 3 мин.
Запись отражает скорость базального потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза. Для регистрации сопряженного потока электронов в ячейку через отверстие в крышке шприцем вносят О,! мл раствора АДФ (конечная концентрация 1 мМ). Па диаграммной ленте отмечают момент внесения ЛДФ н проводя! запись в течение 2 — 3 мин. Для исследования разобщенного транспорта электронов в ячейку шприцем вносят 0,1 мл раствора хе!Н4С! (конечная концентрация 10 — ' — 10-' М). Прн изучении действия ингибиторов в реакционную смесь через отверстие в крышке при помощи шприца вводят 0,1 мл — б диурона (конечная концентрация в реакционной смеси 10 10 4 М) или гидроксиламина (конечная концентрация 10 †' М).
Все добавки делают, не выключая свет. 3. Определение хлорофилла в суспснзии хлоропластов Метод определения хлорофилла в суспензии хлоропластов описан в работе 1 данной задачи. 4, Расчет активности реакции Хилла. Активность переноса электронов в ЭТЦ фотосинтеза выражаю~ в мкмолях Ое мг — ' хлорофилла.ч-' Для расчета необходимо предварительно провести калибровку электрода, а) Калибровка электрода по кислороду Цель калибровки — определить цену деления 1 мм (1 см) диаграммной ленты по кислороду и выявить прямолинейную зависимость показаний электрода от концентрации кислорода в среде. КалибРовку можно проводить с использованием )чатЗОз, либо суспецзии дрожжей (биологическая калибровка по Чансу). В обоих случаях обеспечивается обеднение по кислороду среды, находящейся в ячейке.
Разница между начальным содержанием Ок в среде и конечным, нулевым на диаграммной ленте будет соответствовать тому количеству кислорода, которое находится в среде прн даггньх ионном составе, температуРе, давлении. Зная растворимость О; при данных условиях (по табл. 13 находят количество кислорода, мг1л дистиллирован-. 77 о,о 0,2 Таблица 13 Зависимость содержания растворенного в днстиллированиоя воде кислорода (мг7л) от температуры при атмосферном давлении 0,101 Мпв и парциальном давлении О, 20,9р72 те~ кереттре ДССР~ЫС ДОЛН ГРПЛтер Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1. Результаты запишите в таблицу. Рассчитайте активность базального, сопряокенного и разобщенного потоков электронов в хлоропластах. Оцепите степень воздействия АДФ, разобщителей и ингибвторов потока электронов на скорость переноса электронов в ЭТЦ фотосинтеза (за 100ого принимают скорость базального потока электронов).
9,74 9,70 18 19 20 21 22 23 24 25 9,67 9,49 9,33 9,16 9,00 885 8,70 8,56 9,63 9,46 9,29 9,13 8,97 8,82 8,68 8,54 9,60 9,42 9,26 9,09 8,94 8,79 8,65 8,51 9,56 9,53 9,36 9,36 923 9 !9 9,06 9,03 8,9! 8,88 8,76 8,73 8 62 8,59 ной воды), рассчитывают его количество в обьеме ячейки. Основываясь на этих данных и зная величину отрезка диаграммной ленты, соответствующего данному содержанию кислорода, можно рассчитать цену деления диаграммной ленты в мкмолях 02. Пример расчета.
При 20'С в 1 л дистиллированной воды растворяется 9,39 мг 02 » 3,5 мл » » хмг02 9,39. 3,5 х= — ' ' - =32,87 10-2 мг 02=1,027 10-а ммоль Оо. Таким образом, в ячейке содержалось 1,027 мкмоль кислорода. По калиоровке 300 мм — отрезок на диаграммной ленте от начального до конечного (нулевого) уровня кислорода в ячейке, т.
е. 300 мм диаграммной ленты соответствуют 1,027 мкмоль От. Отсюда 1 мм диаграммной ленты соответствует 1,027!300 мкмоль 02. б) Расчет по диаграммной записи (см. рис. 8). 1. Из любой точки экспериментальной линии опускают перпендикуляр а к горизонтальной линии н измеряют его величину, мм. Эта величина соответствует изменению концентрации 02 в ячейке за время, соответствующее отрезку б. Исходя из калибровки цены деления диаграммной ленты в мкмолях 02 (см.
выше), определяют эту величину в мкмолях 02. 2. Измеряют величину отрезка б, мм, и исходя из скорости. движения диаграммной ленты, выражают ее в единицах времени, ч. 3. Зная количество кислорода, выделившегося за время б, рассчитывают количество кислорода, выделившегося за 1 ч. 4. Пересчитывают количество кислорода, выделившегося за 1 ч, на 1 мг хлорофилла (учитывают количество суспензчи хлоропластов, внесенное в ячейку, и величину рассчитанной.
концентрации хлорофилла в суспензии). ЗАДАЧА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИКЛИЧЕСКОГО ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ Опыты с изолированными хлоропластами показали, что при ,фотосинтезе энергия квантов света, поглощаемая хлорофиллом, переходит в энергию химических связей молекул АТФ. Этот процесс назван фотосинтетическам фосфорилированием в отличие от окислнтельного фосфорилирования при дыхании. Фотофосфорнлирование на хлоропластах шпината было открыто в 1954 г.
Ар~новом. Согласно теории электронного потока Лрмона индуцируемый светом ток электронов в хлоропластах сопряжен с образованием ЛТФ. Свободная энсргня, необходимая для синтеза АТФ, высвооождается в определенных участках ЭТЦ, где происходит перенос электрона по градиепту термодинамнческого потенциала. При наличии сопрягающих механизмов эта свободная энергия может быть зафиксирована в макроэргических связях ЛТФ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
