А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 22
Текст из файла (страница 22)
17) состоит из 13-образной капиллярной трубки, которая соединена у основания с резервуаром (резиновая трубка), заполненным манометрической жидкостью. Правое колено трубки соединяется с сосудиком посредством хорошо смазанного стеклянного шлифа, левое (открытое) — с воздухом. П-Образная трубка имеет миллиметразую шкалу, По этой шкале можно регистрировать изменение уровня жидкости в открытом колене манометра, На правом колене примерно в середине шкалы (возле отметки 15) 4 устанавливают контрольную точку сравнения, к которой подводят уровень жидкости в правом колене, перед тем как снимать показания. Это гарантирует проведение всех измерений «у при постоянном объеме. Манометр с хорошо притертым со- 1 судом и открытым краном на правом колене помещают в термостатируемую водяную баню. П-Образная трубка крепится на штативе, а сосуд погружается в воду. Для поддержания равновесия между газом в растворе и Рнс.
17 Раакннонный со- суд с манометром к гагазовой фазой сосудик качают с ча воматрнческом аппарату У стотой 100 — 120 раз/мин, чтобы снять Варбурга (нонсненне см. ограничение, связанное с днффузией в тексте) из газовой фазы в жидкую. Сосудики термостатируют с открытым краном в течение 20 мин, затем уровень манометрической жидкости в правом колене подводят до контрольной метки и кран закрывают. В ходе эксперимента перед каждым отсчетом показаний уровень жидкости в правом колене подводят до контрольной метки «15» (точки сравнения) с помощью регулировочного винта на Резервуаре с манометрической жидкостью. Затем замеряют Уровень жидкости й в левом колене. Поскольку жидкость в левом колене сообщается с воздухом, на величине Й будет сказываться изменение барометрического давления.
Кроме того, А будет зависеть и от незначительного колебания температуры водяной бани. Для устранения обоих источников ошибок применяют термобарометр, Он представляет собой второй манометр, полностью идентичный первому, за исключением того, что реакционная ~месь в нем заменена равным объемом буфера или воды. 92 Любые изменения в уровне жидкости й~ в левом колене вто рого манометра используют для коррекции наблюдаемых зна.
чений, Если й~ изменяется в том же направлении, что и Ь, то й, вычитают из й, если изменения происходят в протнвополож. ных направлениях, то й~ н й складывают. Изменение уровня манометрической жидкости й связано с количеством выделившегося илн поглощенного газа Х следую шим уравнением; як +Уса Сосудик 2 (бвз КОН). Изменение объема определяется сортношением между обьемами поглощенного О, и выделившегоя СО . Если обозначить константы сосудика как й"о, и й" соса ся 2 в а наблюдаемые изменения показаний через й, то Хо, Хсо, Отсюда Хо. / м Ь'в'о,'1 где !'к — объем, занимаемый газом (объем сосудика плюс объем капилляра от сосудика до точки сравнения), мм'! )'! — объем жидкости в сосудике, мм'! а — растворимость газа (О, илн СО,) в жидкости, находящейся в сосудике, мм'! Т вЂ” температура водяной бани, К; Ра †стандартн давление, мм манометрической жидкости.
Плотность манометрической жидкости доводят до 1,034 гл Хсм-а (обычно жидкость Броди), так что Ре=10 000 мм. Поскольку для каждого конкретного сосудика и для каждой реакции, которая протекает при определенных условиях, все вели чины, находящиеся и скобках в уравнении, постоянны, можно записать: Х=йк, где й — постоянная сосудика. Проведение измерений возможно при неизменной концентрации одного из газов. Для этого в центральный цилиндр сосудика (сосудик 1) помещают раствор КОН для поглощения СОв, выделяющегося в процессе эксперимента В этом случае изменение давления в манометре обусловливается количеством поглощенного Оа.
Однако с помощью манометра Варбурга можно определить одновременно выделение СО, н поглощение, О,. Для этого берут второй манометр с той же реакционной смесью, что и первый, однако не добавляют в сосудик КОН (сосудик 2), Таким образом, одновременно измеряют изменение объема двух газов — О, и СОъ заметно различающихся растворимостью. Порядок расчета приведен ниже. Сосудик 1 (с КОН).
Изменение объема обусловлено поглощением Ою Если константы сосудика для Оа и СОе обозначить как й'о, и й'со„то Хо,=ая о„ где й' — изменение показаний манометра, Хо, — объем утили- зированпого кислорода. Следует помнить, что суммарное изменение объема газа н соотнетствуюшие ему показания манометра принято считать отрицательными, т, е, й' отрицательно, отрицательным может быть и й". Таким образом, по разнице показаний двух манометров определяют количество выделившегося СОъ Данные, полученные для двух сосудиков, используют длн расчета интенсивности поглощения Ое и выдечения СО,. На основе этих данных можно рассчитать отношение СОа к Ов.
Это отношение называют дьсхатвльныт коэффициентом (ДК). Величина ДК может характеризовать субстрат окисления, Прн окислении углеводов ДК= 1, при окислении органических кислот ДК)1, при окислении липидов ДК(1. Однако это справедливо при условии, если исключены возможность неполного окисления субстрата н вклад окнслительных процессов, происходящих с участием кислорода, но не связанных с выделением СО, С помощью манометрического метода можно исследовать.
также влияние ингибиторов и разоби(игвлей на интенсивность дыхания. В качестве ингибитора гликолиза может быть использован г(аЕ (0,02 — 0,05 М раствор в фосфатном буфере, рН 4,5); ингибнтор цитохромоксидазы ЭТЦ митохондрий — азид натрия (0,02е1а-й раствор в фосфатном буфере, рН 5,5); разобшитель— 2,4-дннитрофенол (10 ' — 10 а М раствор ДНФ в фосфатном буФере, рН 5,0). Цель работы.
Определить интенсивность поглощения кислоРода и ДК в зависимости от вида растений, физиологического состояния и условий выращивания растении. Реактивы и оборудование: 20ай-й раствор КОН; 0,06 М фосфатиый буФер; 002 — 005 М !Чар в фосфатиом буфере, рН 45; 10-' — !О-' М динитрефевол в фосфатиом буфере, РН 6,0; 3%-й раствор сахаровы; колбы объемем 250 и 500 мл; воронки стеклянные; капроновая ткань с размером ячеек 60М90 и 120К120 мкм; пробочиые сверла; скальпель; пинцет; шприц с алкиной иглой; торсиоииые и аналитические весы; вакуумная смазка; вакуум-вксикатор; аппарат Варбурга; центрифуга ЦЛС-З.
Объекты исследования: прорастающие семена пшеницы и подсолиечииРастения разных видов и разного возраста; проростки пшеницы, выра"~сивые при различных условиях водоснабжения, суспензия клеток моркови 95 различного возраста и разного физиологического состояния; каллус моркови различного возраста; суспензия водорослей Сшосеиа, Лпаьаепа. Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. 1. Под готовка растительного материала При работе с листьями рас гений мелкие листья можно взять целиком, из больших листьев делают высечки сверлом диаметром 10 мм, листья пшеницы на резают из центральной части листа кусочками размером 0,5 см В случае анализа действия ингибиторов и разобщителей на интенсивность поглощения кислорода растительными тканями производят вакуум-инфильтрацию исследуемого вещества в ткань.
Для этого навеску растительного материала заворачивают в марлю, кладут в стакан и заливают исследуемым раствором. Сверху помещают груз и накрывают стакан воронкой. Помещают стакан в вакуум-эксикатор, хорошо притирают крышку эксикатора, подсоединяют эксикатор к электрическому масляному вакуумному насосу и откачивают воздух в течение 20 — 30 мин. Когда из растительного материала перестанут выделяться пузырьки воздуха, кран эксикатора закрывают и отсоединяют его от насоса. Затем кран медленно открывают, при этом жидкость заходит в межклетники ткани.
Кусочки вынимают, обсушивают фильтровальной бумагой и используют для проведения опыта. Параллельно делают контрольные пробы, инфичьтруя их буферным раствором без ингибитора. При работе с водорослями их суспензию центрифугвруют в предварительно взвешенных центрифужных пробирках в течение 10 мин при 1000 д. Надосадочную жидкость аккуратно оттягивают шприцем, взвешивают пробирку с осадком и затем добавляют к нему 3%-й раствор сахарозы из расчета 1 мл на 250 мг. В каждый сосудик вносят по 2 мл суспензви.
При работе с культурой клеток суспензию клеток фильтруют через капроновую ткань с размером ячеек 120Х120 мкм, при этом фракция крупных ассоциаций клеток остается на ткани. Затем фильтрат вновь фильтруют через ткань с меньшим размером ячеек (60ХОО мкм), иа ткани при этом осаждается необходимая для анализа фракция клеток. Клетки промывают на фильтре раствором сахаровы, затем подсушивают на фильтровальпой бумаге и используют для взятия навесок для анализа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
