А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Субстратами липоксигеназ (ЛОГ) в высших растениях являются ди- и триненасыщепные жирные кислоты: лииолевая (Сжз) и лииолеповая (Смж), наиболее широко представленные в большинстве растительных тканей (до 80о)о ацильных групп лнпидов мембран хлоропластов). Продукты реакции окисления представлены гидроперекисями липидов. Окисление сопровождается образованием свободных радикалов. Липоксигеназы — мономерные белки с молекулярной массой 94 — 97 кДа.
Липоксигеназы представлены в виде ряда изоформ. В семенах бобовых растений различают три формы, или изоэнзима: ЛОГ), ЛОГ2 и ЛОГЗ. Эти формы имеют различные оптимумы рН, субстратную специфичность и, по-видимому, играют различную роль в растении. Оптимум рН активности для ЛОГ! — 9,5, для ЛОГ2 — 6,5; для ЛОГЗ отмечен широкий интервал рН; 4,5 — 9,0, определение ее активности проводят при РН 7,0 Липоксигеназа 1 наиболее эффективна в гидропероксидации свободных или полярных жирных кислот.
Липоксигеназы 2 и 3 более эффективны в пероксидации нейтральных жирных кислот или их эфиров, например этиловых эфиров жирных кислот. Липоксигеназа 3, по-видимому, наиболее активна в генерации синглегного кислорода. В семенах бобовых наиболее представлена ')ОГЗ, затем ЛОГ) н наименее — ЛОГ2. Однако ЛОГ2 обладает наиболее высокой удельной активностью. Субклеточная локализация липоксигеназ в различных растителщ|ых тканях ныщииакова, В семенах бобовых большая 111 часть липоксигеназ находится в цитоплазме, в листьях — в пла. стидах, в корнях — в вакуолях.
Возможно, что различные изоэнзимы липоксигеназ имеют разную локализацию в клетке. Физиологическая роль липоксигеназ исследована недостаточно, однако имеется, по крайней мере, три области физиологии растений, где выявлено участие липоксигепаз: рост и развитие, старение, раненой эффект и устойчивость к паразитам, Так, наибольшая активность ЛОГ наблюдается в растущих тканях с высокой метаболической активностью (в апексе, в молодых быстрорастущих листьях). Отмечается изменение активности ЛОГ прн дифференцировке тканей.
Гибберелловая кислота (ГЛз), снимая ингибирующее действие света на рост гипокотиля у капусты, стимулирует липоксигеназную активность. Происходит также изменение изоэнзимного состава и активности ЛОГ во время созревания семян. Возможно, при созревании семян /!ОГ способствует деградации клеточных мембран и увеличению транспорта запасных продуктов к развивающемуся зародышу. Роль ЛОГ в старении связывают с вовлечением фермента в синтез жасминовой кислоты через образование 13-гидропироксиллиноленовой кислоты, которая может быть промотором старения растительных клеток.
Считают, что жасминовая кислота обладает свойствами ретарданта, как и абсцизовая кислота. Липоксигеназа может быть вовлечена в альтернативный синтез абсцизовой кислоты из каротиноида виолаксантина. Липоксигепаза и гидроперекисные продукты ее действия способны прямо участвовать в старении. Гидроперекиси жирных кислот могут вызывать старение различными путями, включая инактивацию синтеза белков, ингибирование фотохимической активности хлоропластов, нарушение цитоплазматических мембран, приводящее к увеличению их проницаемости для ионов.
Последнее ведет к изменению ионного баланса клетки, нарушению ее метаболических реакций. Раненой эффект и защиту растений от заражения микробами считают главной функцией ЛОГ. Липоксигеназа участвует в синтезе травматина при повреждении, Гидроперекиси жирных кислот, продуцируемые ЛОГ, могут служить основой при образовании токсинов для микроорганизмов.
Липоксигеназа играет важную роль в прямой и опосредованной формах устойчивости растений к паразитам. При поражении увеличиваются количество ЛОГ и ее активность. Радикалы гидроперекиси липидов, образующиеся при действии ЛОГ, токсичны для паразитов, Установлено, что ЛОГ играет важную роль в реакции снерхчувствительности при патогенезе растений. Определение активности липоксигеназ может быть произведено либо спектрофотометричсски (А=234 †2 нм) с помощью регистрации образования при гидропероксидации нена- ыщенных жирных кислот конъюгированных диенов, либо по„ирографически путем регистрации линолеатзависимого погло1цения кислорода. Цель работы.
Определить активность липоксигеназ полярографическим методом в тканях растений различного возраста, Реактивы и оборудование: среда выделения (1/15 М фосфатный буфер, Н 5,5; 1'/а-й раствор альбумина; 0,35 М раствор сахаровы; 0,1'/,-й аствор ас скорбата На); препарат лнноленовой (линолевой) кислоты (1,3 мй( лино- левая нлн линоленовая кислота, деспергированная в растворе, содсржашем 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,5, 0,15' -й раствор таина-20, 0002', -й раствор азнда натрия); полнвннилпирролидон (НВП); жидкий азот; фарфоровая ступка с пестикам; пробирки объемом 5 мл; пипетки объемом 1,2 и 5 мл; шприц с длинной иглой; центрифуга; полярографичесьая установка с закрытым злектродом Кларка.
Объект исследования: листья и корни гороха разного возраста. Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов, 1. Пригоговлгние препарата лииоисигеназоь 1-(авеску растительного материала (2 г) охлаждают в ступке на льду, затем замораживают жидким азотом и растирают с 150 мг ПВП. Г!осле оттаивания растительного материала в ступку добавляют 5 мл среды выделения, вновь хорошо растирают смесь н настаивают на льду 15 — 20 мин. Затем гомагеиат переносят в пробирку и центрифугируют 10 мни при 4000 об/мин. Полученный супернатанг аккуратно оттягивают шприцем, переносят в чистую пробирку и используют для определения липоксигеиазной активности, 2, Определение активности липоксигеназ. Определение активности ЛОГ проводят на полярографической установке, Описание установки и порядок работы на ней приведены в Приложении П.
В полярографическую ячейку помещают 2,5 мл препарата линоленовой (линолевой) кислоты и 1 мл свежеприготовленного препарата фермента. Аккуратно, ввинчивающим движением, закрывают ячейку крышкой так, чтобы не было пузырька воздуха, и регистрируют скорость поглощения кислорода препаратом.
3, Расчет активности фереигнга. Расчет проводят согласно описанию, приведенному в задаче 3 равд. 1П. Активность фермента выражают в микромолях кислорода на 1 г сыров массы за 1 ч. Оформление работы. См. равд, 1, задача 1. ЗАДАЧА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПО ОБРАЗОВАНИЮ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГНДА В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ Окислительные процессы в живых организмах в ряде слу"аев происходят при участии свободных радикалов. Индуциро- 112 113 ванне этих процессов часто обусловлено кислородными радикалами: супероксидным аннан-радикалом Оз, гидроперекисным радикалом НОз, гидроксильным радикалом 'ОН, стабильным продуктом восстановления кислорода — пероксидом водорода Н,О,, а также синглетным кислородом. Возникновение этих ак. тинных форм кислорода связано как с процессами, происходящими в клетке в норме (например, в световых реакциях при фотосинтезе), так и в ответ на стрессовые воздействия (водный дефицит, загрязнение среды, низкие температуры, действие гербицидов и т.
д.). Изменение активности процессов генерации активных форм кислорода наблюдается и в онтогенезе растений. Важное место среди систем, генерирующих активные формы кислорода, занимают окислительные ферментьз клетки. Показано образование этих форм кислорода в ходе реакций окисления, катализируемых пероксидазой, ксантиноксидазой, липоксигеназой и др. Отмечена возможность образования активных форм кислорода в результате работы электрон-транспортной цепи фотосинтеза и дыхания. Особая роль, по-видимому, принадлежит цианид-устойчивому пути переноса электронов в ЭТЦ митохондрий. Генерация актнвированных форм кислорода может вызывать повреждения в клетке, и в первую очередь повреждение мембранных структур. Причиной этих повреждений являются свободнорадикальные процессы, приводящие к перекисному окислению ненасыщенных жирных кислот липидов мембран.
При действии кислородных радикалов происходит отрыв атома водорода от молекулы ненасыщенной жирной кислоты с образованием свободного радикала и далее гидропероксида этой кислоты. В результате окисления моноеновых жирных кислот (олеиновой) образуется четыре изомерных гидропероксида. В случае полиеповых жирных кислот, как следствие делокализации неспаренной валентности, двойная связь мигрирует с образованием конъюгированного дненового хромофора, поглощающего в ультрафиолетовой области (максимум — около 232 нм), Процессы перекисного окисления липндов с участием форм актнвированного кислорода приводят к разрушению полнненасыщепных жирных кислот и обеднению клетки содержащими их полярными и ненасыщенными жирными кислотами, появленикз гидропероксидных группировок в составе гидрофобной зоны мембран. Это изменяет физико-химические свойства мембран: текучесть, способность к латеральной диффузии, что приводит к отклонению в функционировании мембранно-связанных ферментов, увеличивает проницаемость мембран для многих веществ и ионов.
Кроме зого, лнпндные пероксиды вызывают разрушения многих физиологически важных соединений, таких, как „,,дьфгидрильные соединения, гормоны, стеронды и др. Продук"з псрекисного окисления липидов способны ингибировать реп„нкацию ДНК и белковый синтез. Возможно появление внутри, межмолекулярных ошибок в результате свободнорадикальной „олимернзации и поликонденсации с некоторыми продуктами „ рекисного окисления лнпидов, например с малоновым диальдегидом, Малоновый диальдегид (МДА) — - продукт перекнсного окисления липидов.
Этот бифункциональный альдегид способен обазовывать шиффовы основания с аминогруппамн белка, вызупая в качестве сшивающего агента. В результате образукзтся нерастворимые белок-липидные комплексы, называемые пигментами изнашивания или липофусиинамиз НС вЂ” СНз — СН 1~ !! О О Малоновый диальдегид В ответ на различные стрессовые воздействия в тканях растения происходит увеличение содержания МДА, что связано с активацией в этих условиях свободнорадикальных реакций в клетках. Таким образом, содержание МДА может служить показателем активности окислительных процессов, обусловленных кислородными радикалами.
Определение содержания МДА в растительных тканях основано на его реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), в результате чего образуется окрашенный продукт с максимумом поглощения при 532 нм. Цель работы. Исследовать влияние условий выращивания растений на содержание МДА в растительных тканях. Определить изменение содержания МДА в зависимости от возраста растений. 20 .м Ревктявы в оборудование: 20з -й раствор ТХУ; 0,5%-й раствор ТБК р хвор в Тз-м растворе ТХУ; фзрфоровые ступки с пестиком; мерные пробирки объзком 5 ком 2 5 мл с првтеряымв пробками; лабораторные пробвркв; пипетки б во ъв 5 мл; шприц с длинной иглой; водяная баня; весы аналитические; Пзвтряфугз; спектрофотометр Объ рззля екты яззледоввккя: листья проростков пшевяцьх вырзщевных пр чвых условиях водосязбжеяяя; листья гороха различного возраста, ри Х од работы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
