А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Навеску исследуемого материала (0,5 г) измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке с 3 мл 4нст иллированной воды. Затем к гомогенату добавляют 3 мл ТХу отби а и повторно гомогенизнруют. Из полученного гомогеиата ао 2 рают в мерные пробирки с притертыми пробками две пробы мл.
К одной из проб добавляют равный объем (2 мл) ТХУ; спек з дальнейшем эту пробу чспользуют в качестве контроля при трофотометрии. К другой пробе приливают 2 мл раствора ВК тем К. Пробы инкубируют 30 мин на кипящей водяной бане, заохлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об мин.
115 Супернатант аккуратно отбирают шприцем в пробирки и промеряют на спектрофотометре или Спеколе (Х=532 нм). Колк чество МДА (А) в растительной ткани выражают в паномолях МДА на 1 г сухой массы и рассчитывают по формуле тт~~з!сей а А Ре где Реее — значение оптической плотности при 523 нм; )7 — объем реакционной смеси (4 мл); а — отношение общего объема вытяжки к обьему пробы, взятой для определения МДЛ; а-- молярный'козффициект экстиикции, равный 155000 л см — 'Х Х моль-'! Р— навеска растительного материала, г. Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1. ЗАДАЧА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ СОПРЯЖЕННОСТИ пОГлОщения кислОРОдА с синтезОАт АтФ пО РеАкции НА ДИНИТРОФЕНОЛ В процессе дыхания происходит сопряженный с окислитель- но-восстановительными реакциями синтез АТФ. На первых двух стадиях дыхания — в гликолизе и цикле Кребса — синтез ЛТФ прочно связан с окислекпем субстрата и протекает по меха низму субстраткого фосфорилирования.
Однако эти две стади~ малоэффективны в отношении образования АТФ (4 моля АТП на 1 моль глюкозы). 11аиболее «знергодающей» стадией дыха ния является работа ЭТЦ митохондрий и сопряженный с не! синтез АТФ. Синтез АТФ, сопряженный с работой ЭТЦ, пазы вают окислительным фосфорилированием в дыхательной цепи Организация ЭТЦ митохондрий растений и локализация мес' синтеза АТФ представлены на рис. 19.
Механизм синтеза АТФ, сопряженного с окислительно-вос становительнымп реакциями в ЭТЦ, подобен механизму синге за АТФ в хлоропластах. В обоих случаях идет преобразованы энергии, высвобождающейся при окислительно-восстановитель кых реакциях, в энергию макрозргических связей АТФ чере промежуточную стадию образования электрохимического гра диента протонов. Такая опосредованная связь синтеза ЛТФ с окислительно восстановительными реакциями в ЭТЦ приводит к возможност разобщения перекоса электронов от восстановителей (НАД ! и ФАД.Н,) на кислород от процессов синтеза АТФ. При зто' поток электронов в ЭТЦ и поглощение кислорода растениями не связаны с синтезом АТФ. Такой поток электронов называю разоби!енным в противоположность потоку электронов, связан ному с синтезом АТФ и назьнеаечому сопряженным.
Разобщенный поток электронов можно наблюдать !п ч!чо растениях на определенных этапах онтогенеза, при измепепн условий выращивания растений и др. При этом происходи' 116 тивация потока электронов в ЭТЦ, ускоряется окисление восэхт ановленных коферментов, что в определенных условиях споста соо оствует усиленной работе цикла Кребса и синтезу интермедиатов, ов, необходимых для метаболических реакций. Часть или вся эяе яергия, высвобождающаяся при работе ЭТЦ в условиях разоб„1ения, выделяется в виде теплоты (явление термогенеза). Разобщение потока электронов и синтеза АТФ может быть остигнуто также искусственно, при использовании специфически ких веществ — разоб1цителей. Природа этих веществ может быть различна, но все они разрушают градиент протоков и тем самым нару1пают синтез АТФ в митохондриях.
Одним из разобс1ителей, эффективно влияющих на систему сопряжения митохондрий, является 2,4-динитрофенол (ДНФ). Под влиянием разобшителей происходит активация погло1пения кислорода в ЭТЦ дыхания, поскольку снимается контроль потока электронов со стороны сопрягающей системы митохондрий — АТФ-синтетазного комплекса митохондрий. Поэтому степень стимуляции поглощения кислорода митохондрнями при добавлении разобщителей может служить показателем сопряженности потока электронов в ЭТЦ с синтезом АТФ.
ДНФ применяют и на целых тканях. При этом стимуляция поглощения кислорода тканями может служить косвенным показателем сопряженности поглощения кислорода и фосфорилирования. Несмотря на некоторые сложности интерпретации результатов, этот показатель может быть использован для характеристики работы системы сопряже|пия митохондрий. Удобным методом исследования ЭТЦ и сопрягающей системы митохондрий является полярографический метод с использованием закрытого электрода Кларка.
Этот метод позволяет производить довольно быстрые измерения активности работы ЭТЦ по скорости поглощения кислорода, а также исследовать дейстане различных ве|цеств (субстратов окисления, АДФ, разобщителей и ингибиторов дыхания) на активность этого процесса с целью определения механизмов регуляции работы ЭТЦ митохондрий. Теория полярографического метода Поляросрафит представляет собой чрезвычайно чувствитель"Ый метод, позволяющий работать с очень разбавленными растворами и небольшими объемами.
С его помощью можно выявить наличие того или иного вещества в препарате, определить его концентрацию. С помошью полярограсрии изучают как быстрые, так и медленные реакции. Ее широко используют при Работе с ферментами (например, с каталазой и пероксидазой), с изолированными оргапондами клеток, с тканями и органами. Основной недостаток полярографии — побочные эффекты, которые не всегда легко устракимы.
117 е г Рнс. 20. Полярографнчеекая са выражае волна (обълспенне ем. в Фана, тексте) С ' — С а (=пГггл А где 1 — скорость процесса, выраженная величиной плотности тока; п — число электронов, участвующих в процессе; Р— число Фарадея; Вл — коэффициент диффузии вещества А; бл — толщина диффузного слоя. По мере смещения потенциала Сло падает, 1 — возрастает.
118 Полярографический анализ веществ заключается в проведе. нии электролиза исследуемого раствора в электрохимическор ячейке и интерпретации зависимости между силой тока, харак теризугощей скорость электрохимического процесса, и потенциа лом электрода или приложенным напряжением.
При этом ско. рость электрохимического процесса зависит от потенциала электрода, Метод применим для анализа веществ, способных электро- химически восстанавливаться или окисляться на поверхности электрода. В основе полярографичсского анализа лежат закономерности диффузной кинетики, поскольку кинетика элсктрохимической реакции на рабочем электроде определяется наиболее медленными ее стадиями, имеющими диффузный характер: подводом реагирующих частиц из объема раствора к поверхности электрода и удалением продуктов реакции в объем раствора, Если в растворе содержится некоторое вещество А, способное восстанавливаться на электроде в вещество В, а ско.
рость этого превращейия зависит ог скорости диффузии молекул А к электроду, то зависимость силы тока от потенциала будет иметь вид кривой, называемой полярографпческой волной (рис. 20). Г1ри начальных значениях величина потенциала электрода (участок а) еще не достаточна для осуществления электрохимической реакции и сила тока равна нулю. При этом концентрация вещества А у поверхности электрода Сла не отличается от таковой в глубине раствора Сл'. При смещении потенциала в сторону отрицательных значений начинается электролиз„ скорость которого растет быстрее, чем скорость смещения потенциала (участок б).
Начинается превращение А в В и поверхпостная концентрация Сла становится меньше объемной. В результате возникает диффузионный процесс, напа равленный на выравнивание концен(а, трации А и обеспечивающий подачу А !г йалггнгиьц,' к электроду. Скорость диффузионного процес- тся первыги законо,м „!аконец, при поверхностной концентрации Сла, равной нулю, рость процесса становится максимальной и перестает завискор сгт ть от потенциала электрода (участок в). Величина (а, назыгмая плотностью предельного тока диффузии, прямо пропории иональна коэффициенту диффузии 1)л и обратно пропорциоиа„тьна величине диффузного слоя бл.. Са' (а=пРРл л Пропорциональная зависимость между величиной предельного тока диффузии и конпентрацией вещества в объеме раствора и является основой количественного полярографического впал мза.
Величина а)л постоянна для данных частиц в растворе и обычно имеет поРЯдок 10 — ' — 10-а. Величина бл зависит от коэффициента диффузии, кинематической вязкости раствора и скорости движения жидкости Для снижения величины бл раствор перемешивают, что резко уменьшает толщину диффузного слоя и увеличивает предельный ток диффузии. При этом важен строго определенный режим перемешивания растворов, для поддержания которого используют магнитные мешалки или вращающиеся электроды. Скорость диффузионного процесса ие зависит от природы электрода или состояния его поверхности. Потенциал полуволны ~рпг является величиной, характерной для данного соединения, и может быть использован для идентификации последнего. На основе полярографии (вольгаметрии) возможно измерение содержания кислорода с помощью ртутного и платинового электродов. При электролитнческом восстановлении кислорода образуется полярографическая волна, по которой и определяют его содержание.
Наиболее часто для анализа концентрации кислорода применяют платиновый закрытый электрод Кларка. Обычно приложенное напряжение поддерживают постоянным (потенциал полуволны г(чгг) и измеряют силу тока, которая заВисит от концентрации кислорода. Когда платиновый электрод используют в сочетании с хлорсеребряным анодом, электродная реакция идет следующим образом: АНод 4Ао+4С1-з-4АдС!+4й Катод 4Н++4е+Оа — а-Н О 4Н++ 4Ад+ 4 С 1-+ Оа — ~ 4АиС! + 2НаО Если напряжение нз электродах сосзавляет 0,5--0,8 В, то сила тока, возникающего при этом, прямо пропорциональна концентрации кислорода в растворе. Электрод Кларка (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
