А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Здесь же показаны некоторые альтернативные пути окисления органических субстратов, реализуемые в растительной клетке. супстяаты Кнтаинип кылома — — млд- геь Комплекс К ф Дмпй мгиппт к' кислпта К'П Ьссп-вппг-ссы сС-Кетоелутаио- ~ -т Вин кислптп Иоплимонно и НЯД Нь„, Юнн - ге 5 кислолга кислпта НЯДНм, — — тЯД— с а.-аг - Пе сг' сйз сйк Комллыс го Ксан~. Яелкмгнмнал тесни - а нальнап пксипила пв -пь -пвг -пм опг пог .огв огг пм пгу.пм пег якссслительни - Впсстанпйтельньси патенципи Ео, В Рнс.
18. Альтернатнвные пути терминального окисления: о-ДФО н р-ДФО— орта- н парадкфенолоксндаза, МФΠ— монофенолоксндаза; НАД(Ф) — НАД н НЛДФ, Фп — флавопротенн, 11Нь — субстрат окнслеккя Ряд оксидаз содержит железо в виде гема (цитохромоксидаза, пероксидаза, каталаза), другие ферменты могут содержать медь (аскорбатоксидаза, полифенолоксидаза) либо молибден. Оксигеназы. Ферменты, осуществляющие включение одного (лсоноонсигеназы) или двух (диоксигенпзы) атомов кислорода в молекулу субстрата. Оксигеназы участвуют в метаболизме таких соединений, как стерины. Чаше всего оксигеназы необходимы для катаболизма веществ, содержащих неполярные группировки, которые не поддаются действию других ферментов.
Диоксигеназы разрывают двойные связи ароматических соеди- !02 Рне. 19. Электрон-транспортная цепь мнтохондрнй растений: Ф вЂ” положение мест фосфорнлнрованнн, ФЛД, ФМН вЂ” флавопротенны; Рез — железосерные белки; и, Ь, с — цнтохромы; КоΠ— убнхннон; контурами обведены структурно-функцнональные комплексы Цель задачи, Определить активность некоторых окислительНых ферментов в зависимости от условий эксперимента.
РЛБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩГзй ДЕГИДРОГЕНЛЗНОИ АКТИВНОСТИ МЕТОДОМ ТУНБЕРГА Дегидрогеназы, находящиеся в клетке, осуществляют окисление различных субстратов путем отнятия водорода и передачи н его на коферменты дегидрогеназ (пнридиновые или флавиНов оные). Общая активность работы дегидрогеназ в растительных тка канях может быть оценена путем определения скорости восста ановления искусственных редокс-агентов, общим свойством 103 восстановление ",фдихлорфенолнндофенолма натрия Воссгановление тетрашлия хлористого !05 которых является способность принимать электроны от восстановленных коферментов дегидрогеназ. В качестве таких агентов могут быть использованы 2,6-дихлорфенолиндофенол, тетразолий синий, Эти системы характеризуются изменением цвета в процессе восстановления.
Ввиду этого скорость восстановления красок может быть оценена и визуально, и спектрофотометрически. с ! о= рг ~ ~т О!лл ф 2Н с! с! — но ~ и они / ~ ! с! Цель работы. Определить дегидрогеназную активность в прорастающих семенах гороха по скорости восстановления 2,6- дихлорфенолиндофенола. Реактииы и оборудование: 50 мМ Раствор КхНР а; р О; 5 !0-4 М астаор 2,6- феиолиидофеиолита На; фарфоровые ступки с пестиком; трубки , -дихлор Тунберга; пипетки объемом 2 и 5 мл; иазелии; иакуу и; р тируемая водяная баии иа 37' С; секундомер.
Объект исследования: проросшие семена гороха. 104 Ход работы. Проросшие семена гороха (корешок не должен быть длиннее 0,5 см) очищают от оболочки и разделяют па семядоли и зародыши, Навески зародышей (100 — 200 мг) и семядолей (300 — 500 мг) отдельно растирают в ступке с 1 мл раствора К2НРОе. Гомогенат переносят в трубку Тунберга, а ступку дважды ополаскивают раствором К,НРОе, кагкдый раз добавляя по 1 мл раствора. Таким образом пробу количественно переносят в трубку.
Конечный объем гомогеиата 3 мл. В шарообразное расширение пробки трубки Тунберга вносят 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолнпдофенолята Ха, смазывают шлиф вакуумной смазкой, вставляют в пробирку н хорошо притирают шлифы, вращая пробку с небольшой амплитудой. Пришлифованные поверхности прозрачные. Совмещают отверстия пробирки и крышки и откачивают из пробирок воздух на вакуумном насосе в течение 2 — 3 мин. Затем, не отключая насоса, поворотом пробки закрывают пробирку. Подготовленные таким образом пробирки помещают в водяную баню.
После 15-минутной инкубации переливают краску из пробки в пробирку, аккуратно встряхивают последнюю для перемешивания реакционной смеси и замечают время. Пробирку оставляют в термостатируемой бане н периодически встряхивают, следя за обесцвечиваннем реакционной смеси. Отмечают время полного обесцвечивания смеси, отражающее активность дегидрогепаз в пробе. Расчет общей активности дегидрогеназ производят по фор- муле 100 А= —, Р! ' где А — относительная активность (на 1 г сырой массы за 1 мин); ! — время обесцвечивапия, мин, Р— навеска, г. Оформление работы.
См. равд. 1, задача 1. Результаты запишите в таблицу. Отметьте разницу в активност~ дегидрогеназ зародышей и семядолей. РАБОТА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ Пероксидазы (КФ 1.11,1.7) — ферменты, окисляющие субстрат при помощи пероксида водорода Общий вид реакции Н,О,+АН,— в А+2П,О, где А и АН2 — окисленный н восстановленный субстраты соответственно. Субстратами пероксидаз служат фенолы и ароматические соединения, органические гидроперекнси с небольшими алифатнческими заместителями, НАД Н (НАДФ Н), нафтогидрохинон, индолилуксусная кислота и др, Пероксидазы — железосодержащие ферменты, простетической группой которых является гем — феррипротопорфирин 7Х.
Окисление субстратов осущест- вляется, по-видимому, по одноэлектропному механизму. Первой стадией каталитического процесса является образование комплекса между железом фермента и пероксидом водорода. Следовательно, окисление субстрата осуществляется пероксидом водорода, активированным ферментом: Š— НгО+ НгОг — ~ Š— НгОг+ НгО Соединение 1 Š— НгОг+АНг — ь Соединение 2+АН' 'Соединение 2+ АН вЂ” — «Е — НгО+ Л Соединение 1 — окисленная форма фермента, где железо связано с пероксидом и валентное состояние Ге выше Вез+; соединение 2 — продукт восстановления соединения 1 путем одноэлектронного восстановления за счет субстрата АНг, АНг— субстрат реакции; АН' — свободнорадикальная форма окисленного субстрата; А — продукт полного окисления субстрата. В растительных тканях пероксидазы широко распространены: в основном их находят в пероксисомах, обнаружены они также в клеточной стенке. Известно более 20 изоформ пероксидазы с различной каталитической активностью.
Множественность форм фермента и каталитических функций позволяет судить о значительной роли пероксидаз в биохимии и физиологии растений, однако до снх пор их физиологическое значение окончательно не выяснено. Показано изменение изоферментного состава пероксидаз и их активности в онтогенезе растений, при патогенезе, в условиях стресса. Активность пероксидаз наряду с каталазой, очевидно, препятствует накоплению пероксида водорода в клетке. Используя для окисления пероксид водорода, пероксидазы могут играть важную роль в нейтрализации продуктов вторичного обмена (фенолов), в регуляции гормонального статуса растений через окисление индолилуксусной кислоты, образование этилена из метионина, участвуют в процессах синтеза лигнина в клеточной стенке.
Однако одноэлектронный механизм переноса, который осуществляется пероксидазой при окислении субстрата, может привести к образованию активированных форм кислорода (Ог и др.), вызывающих повреждающий эффект в клетке (см. задачу 3 этого равд.). Тем не менее существует мнение, что образованные в пероксндазных реакциях активные формы кислорода могут быть использованы растением в защите от патогена. Определение активности пероксидазог основано на образовании окрашенных продуктов при окислении бензидина, гваякола, гидрохинона, катехола и других фенолов.
Общая схема реакции Пероксидаза Фенол+НгОг — ь Хинон+ 2НгО В данной работе используется наиболее чувствительный и быстрый гнаяколонлтй метод, При действии пероксидаз в присутствии пероксида водорода гваякол окисляется до тетрагваякохинона, что приводит к развитию красно-коричневой окраски в реакционной среде и позволяет провести фотометрическое измерение скорости ее образования. Цель работы. Определить активность пероксидазы в различных органах растения, изменение активности фермента с возрастом растения. Реактивы и оборудование: 1/15 М фосфатиый буфер, рН 6,5 — 6,71 01~,-й РастноР НгОЫ РаствоР гваакола (0,183 г в 50 мл волы); фаРфоРовые ступки с пестиками; мерные колбы объемом 50 мл; стеклянные стаканы объемом 100 мл; средние стеклянныс воронки; пипетки объемом 2 и 5 мл; ввтоматизеские пипетки: бумажные фильтры; ФЭК (КФК-2-УХЛ 4.2); стекляняые кюветы к ФЭКу толщиной 2 см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
