А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 21
Текст из файла (страница 21)
РАБОТА 2. РЕГИСТРАЦИЯ ФОТОИНДУЦИРУЕМЫХ ИЗМЕНЕНИЙ рН ХЛОРОПЛАСТАМИ В УСЛОВИЯХ ЦИКЛИЧЕСКОГО ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЯ Опыт проводят иа потенциометрической установке, описание которой дано в Приложении П. В ячейку вносят среду, содержащую фосфат-акцепторную систему (еАДФ). рН реакционной смеси 8,0 — 8,2 (для подведения РН используют 1 мМ растворы НС! и ЫаОН, добавлять по каплям!). Дождавшись установления стационарного уровня РН в темноте, включают свет и записывают кинетику фотоиндупируемых изменений рН среды. Затем выключают свет и наблюдают за установлением нового стационарного уровня рН.
С целью определения цены деления диаграммной ленты и единицах изменения содержания протонов в исследуемую реакционную смесь вносят определенное количество (0,1 — 0,2 мл) 1 мМ раствора НС! и отмечают на диаграммной ленте амплитуду изменений РН. Полученные данные используют для расчета величины фотоиндуцируемого поглощения протонов хлоропластами и активности циклического фотофосфорилирования. 3. Определение хлорофилла в суспензии хлоропластов.
В мерную пробирку вносят 1 мл суспензив, 1 мл дистиллированной воды и 100агз-м раствором ацетона доводят объем до 10 мл. Раствор хорошо перемешивают и фильтруют через стек- 88 данный фильтр № 2 или № 3. Полученный фильтрат промеряют иа спектрофотометре или Спеколе при А=652 нм (контроль— 80%-й раствор ацетона). Измеренную оптическую плотность раствора 1лазз используют для расчета содержания хлорофилла в суспензии хлоропластов. 1 мл суспензия хлоропластов содержит 0,29 1лаьз мг хлорофилла. Содержание хлорофилла в пробе равно 0,29 Вззз 5 мг.
4 Расчет активности реакиши Для определения велнчиныобратвмого фотовндуцированного процесса поглощения протонов хлоропластами достаточно знать амплитуду изменений рН на свету, цену деления диаграммной ленты в значениях содержания протонов п содержание хлорофилла в опытной смеси. Па основании этих величин рассчитывают число мпкромолей Нг, поглощенных в опыте в расчете на 1 мг хлорофилла. Активность пиклнческого фотофосфорилвровзния определяют но изменению РН при освещении суспензии изолированных хлоропластов в присутствии АДФ.
Для расчета АТФ необходимо знать цену деления диаграммной ленты в едишгпах содержания протонов, время установления стационарного уровня рН на свету, величину необратимого изменения рН (разница между максимальной амплитудой и обратимым изменением рН), содержанве хлорофилла в пробе и значение коэффициента и. Коэффициент и — стехиометрическое .отношение числа молей поглощенных протонов к числу молей поглощенного фосфата при фосфорилвровании АДФ в условиях данного РН: и = Н+/Фц.
Значения п рассчитаны теоретически и определены экспериментально ((ч)!защита е! а!,, 1962). При РН 7,4 величина п=0,89, при рН 8,0 величина п=0,95. Фосфорилируюшую активность хлоропластов выражают в микромолях Фн мг ' хлорофилла ч-'. Оформление работы. См. равд, 1, задача 1. В выводах отметьте связь фотоиндуцируемого поглощения протонов на свету хлоропластами с процессом фотофосфорилирования.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Гаврилснка В. Ф., Ладыгина М. Г'., Хандабина Л. М. Большой пракгнкУм по физиологии растений. М., 1978. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение а биохимию растений. М., 1986. Т. 1, 2. Полевой В. В. Физиология растений. М., 1989. Рубин А. В. Г>нофпзнка. М., 1987. Т. 1, 2. Таердислаз В.
А., Тихонов А. Н., Яковенко Л. В. Физические механизмы ФУнкпноппрапання биологических мембран. М., 1987. Фотосинтез/Пад ред. Говинджн. М., 1987. Т. 1, 2. Фотосинтез и бнопродуктнпносгги методы определения)Пад ред. А Т. Макронасаза, А. Г. Ковалева, М., 1989. Эдвардс Дж., Уокер Д. Фотосинтез Сз- н Сирастеннй: меканнзмы н ре"Уляппк. М., 1986.
Раздел !(( ДЪ|ХАНИЕ РАСТЕНИЙ (ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ) Жизнедеятельность растительных организмов связана с вовлечением кислорода в метаболический и энергетический обмен клеток. Центральное место среди процессов, связанных с поглощением кислорода, занимает дыхание. Дыхание — аэробное окисление органических субстратов до диоксида углерода и воды. Субстратами окисления в клетке являются в основном углеводы, однако ими могут быть также липиды и белки. Общее уравнение дыхания при использовании в качестве субстрата глюкозы: СгНмО,+б Оа- б СО«+б НгО+2721,8 кДж/моль. Биологическое окисление глюкозы в процессе дыхания включает ряд стадий: гликолиз (анаэробные реакции), цикл Кребса и стадию, связанную с работой ЭТЦ дыхания.
Существуют и другие пути окисления субстратов в растении, например окислительный нентозо4ос4атный цикл, в котором используется однократно фосфорилированная глюкоза. Отдельные реакции дыхания в настоящее время хорошо изучены (см. рекомендуемую литературу) . Окисление субстратов в процессе дыхания происходит с участием окислительных ферментов, Первый этап окисления осуществляется дегидрогеназами— ферментами, отнимающими от субстрата водород, терм«шальный этап — оксидазами, передающими восстановительный эквивалент на кислород. Кроме того, в дыхании участвуют ферменты — промежуточные переносчики электронов в ЭТЦ митохондрий.
Дыхание занимает центральное место в энергетике растительной клетки. В ходе дыхания происходит высвобождение энергии органических субстратов и использование ее для процессов жизнедеятельности растений. Большая часть энергии в ходе. дыхания запасается в виде макроэргических связей ЛТФ, однако она может быть использована организмом на стадии образования электрохимического градиента протонов Л«хи~-, а также в виде тепла (термогенез).
Количество энергии, используемое в каждой из этих форм, определяется внешними уело~нами и внутренними потребностями организма. Не менее важна метаболическая роль дыханиа В ходе окисления органических субстратов происходит перестройка уг„аеродных скелетов органических веществ и образование важных промежуточных продуктов, которые используются для синтеза белков, липидов, ароматических веществ и др. Через реакции дыхания в растении осуществляется связь различных процессов обмена веществ.
Восстановленные в ходе дыхания коферменты — НАДФ Н и НАД.Н вЂ” используются в реакциях биохимического синтеза, восстановления нитратов до аммиака, восстановительного амипврования кетокислот и других восстанови- телы«ых процессов. Большую метаболическую н физиологическую нагрузку несут окислительные реакции, связанные с так называемыми альтернатнвнымн путями окисления органических субстратов. Участвующие в этих процессах терминальные оксидазы (например, полифенолоксидаза, аскорбатоксидаза, пероксидаза), а также окспгеназы (например, лвпоксигеназа) контролируют реакции синтеза и распада ароматических веществ, фенолов, регуляторов роста и развития растений и др, В растениях происходит смена терминальных окислительных систем и изменение их .активности в процессе онтогенеза, при смене внешних условий (температуры, концентрации кислорода), в ответ на действие патоген а.
Несмотря на то что общее уравнение дыхания обратно уравнению фотосинтеза, по физиологическому значению эти два процесса близки: дыхание, как и фотосинтез, снабжает клетки энергией и важными метаболитами. Дыхание наряду с фотосинтезом оказывает непосредственное влияние на продуктивность растений. Однако в отличие от фотосинтеза, где процесс в целом направлен против термодинамического градиента за счет поглощенной энергии света, дыхание включает реакции, идущие по термодинамическому градиенту с высвобождением энергии.
Конечной формой запасания энергии прн фотосинтезе являются достаточно стабильные органические соединения (углеводы, белки, липнды); физиологический смысл дыхания состоит в преобразовании энергии этих соединений в более доступную для растения лабильную форму в макроэргические связи ЛТФ. Набор промежуточных метаболитов, синтезируемых и процессе дыхания, значизельно шире, чем набор метаболитов Фотосинтеза. Общая интенсивность дыхательного процесса у растений мо«кет быть охарактеризована по скорости поглощения кислорода и выделения углекислого газа, скорости расходования органи'Ческих веществ. Важными физиологическими показателями дыХательного метаболизма являются также величина дыхатель- ного коэффициента, соотношение различных путей окисления органических субстратов, активность окислительных ферментов.
Активность синтеза АТФ в митохондриях и степень сопряжен. ности этого процесса с работой ЭТИ является характеристикои энергетической эффективности дыхания ЗАДАЧА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ РАСТЕНИИ Дыхание — один из важнейших биологических процессов. Он сопровождается обменом кислорода и углекислого газа с окру. жающей средой. Измерение скорости и уровня газообмена дает простой, удобный и чувствительный метод исследования этого процесса. Для характеристики дыхательного газообмена могут быть использованы различные методы регистрации О, и СОа. полярографический метод с использованием кислородного электрода, потенциометрический метод на основе электродов, чувствительных к СОь и манометрический метод.
В данной задаче будут использованы полярографический и манометрический методы для анализа дыхательного газообмена растений. РАБОТА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ И ДЫХАТЕЛЬНОГО КОЭФФИЦИЕНТА МАНОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ Манометричесхий метод заключается в регистрации изменений количества газа, которые происходят в результате реакции в небольших сосудиках, соединенных с манометром. Манометрия как метод исследования газообмена биологических систем отличается высокой чувствительностью и позволяет вести исследования в строго контролируемых условиях температуры и концентрации СОк Метод дает возможность непрерывно следить за обменом кислорода и диоксида углерода, при гем величина этого обмена не зависит от парциального давления га.
за в начале эксперимента. Метод применяют для изучения клеточных органелл, клеточных суспензий, тканевых срезов и гомогенатов, семян. Однако он подходит только для тех случаев, когда исследуют большое количество материала. Различают три вида маяометрии; манометрия при постоянном объеме, манометрия при постоянном давлении, дифференциальная манометрня. В данной работе используют маномегрию при постоянном объеме. В этом случае обьем газа в сосудике и температура поддерживаются постоянными, а изменение количества газа определяется по изменению давления. По этому принципу действует манометр Варбурга. Манометрический метод Варбурга Манометр Варбурга (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
