А.Т. Мокроносова - Малый практикум по физиологии растений (1134226), страница 31
Текст из файла (страница 31)
25, Установка для определения поглощения калия водорослями (обозна- чение см. а тексте) Ход работы. Работа состоит из нескольких этапов. Изучение поглощения калия культурой водорослей проводя~ на фосфатной буферной смеси (КНзРО4+КОН). Для ее приготовления в колбу объемом 200 мл наливают 5 мл 0,2 М КНзРО4 и 8 мл 0,2 М КОН. Раствор доводят дистиллированной водой до метки.
Концентрация калия здесь составляет 8 10-з мол1л. 1, Калибровка электрода Для калибровки электрода регистрируют показания потенциометра, отмечая уровень записи на ленте самописца при трех значениях концентрации калия в буферном растворе, используемом для поглощения иона. В термостатируемую камеру приливают 8 мл буферного раствора и помещают в раствор электроды так, чтобы они не касались стенок камеры, а шарик измерительного электрода был полностью погружен в раствор. Включают РН-метр и самописец. Выбирают нанболее удобный режим работзаг самописца, используя компенсирующее устройство.
В зависимости от показания рН-метра переключателем устанавливают перо самописца в начале шкалы. Если необходимо, используют плавную компенсацию. После того как устанавливается постоянный уровень записи на ленте самописца, добавляют к буферному раствору 1 мл дистиллированной воды. Регистрируют вновь установившееся показание потенциометра. Еще раз добавляют 1 мл НзО н снова регистрируют показание самописца.
Рассчитыва4от концентрацию калия при первом (8 мл буферного раствора и 1 мл Н О) и втором (8 мл буферного раствора и 2 мл Н,О) разбавлениях, Находят рК для этих концентраций. Определяют, какому изменению рК соответствует 1 мм шкалы самописца. 2 Регистрация поглои(ения калия водорослями. Определяют оптическую плотность культуры на ФЭКе с зеленым светофильтром в кюветах шириной 0,1 см Используя калибровочную кривую для данных водорослей, рассчитывают концентрацию кле- 133 ток в культуре, используемой для задачи, и количество клеток в 100 мл этой культуры, 100 мл суспепзии водорослей центрифугируют в течение 5 мнн прн 2000 об(мны.
Осадок водорослей ресуспевдируют в дистиллированной воде, сливают в одни цептрнфужный стакан и центрифугируют еще раз в том >ке режиме. К осадку водорослей приливают 3 мл дистиллированной воды. Рассчитывают концентрацию клеток в этов суспензин. В камеру наливают 8 мл буферного раствора, па дно ее кладут магнитик и включают магнигную мешалку. В буферный РаствоР опУскают электРоДы, вклгочают освещение и самописец. После того как устанавливается постоянный уровень запис!и, в камеру приливают 1 мл суспензии водорослей.
Регистрируют изменение концентрации калия в среде в течение 20 — 30 мин. Зная, какой величине рК соответствует 1 см шкалы самописца (данные калибровки), расеи!итывают изменения рК (А рК) за каждую минуту после прибавления водорослей и рК в каждый данный момент. По величине рК находят концентрацию калия. Погло1цеиие калия культурой водорослей характеризуют по уменьшению концентрации иона в растворе в единицу времени на 1 млрд клеток.
Оформление работы. Постройте график зависимости поглощения от времени. Подробнее см, равд, 1, задача 1. Варианты опытов. Поглощение калия культурой водорослей Поглощение калия культурами разного возраста. Для выполнения этой задачи берут 4 — 5-дневную и 20 — 25-дневную культуры. Измеряют оптическую плотность. Более густую суспензию водорослей разбавляют так, чтобы культуры разного возраста имели одинакову!о оптическую плотность. Для работы используют по 100 мл каждой культуры.
Далее проводят опыт так, как описано выше, последовательно, т. е. сначала для одной культуры, затем для другой. Влияние освещения на поглощение калия водорослями. Проводят работу в соответствии с описанием в двух вариантах: в темноте и прн освещении. Поглощение калия в зависимое~и от концентрации иона в среде. Для данной задачи используют молодую 4 — 7-дневную культуру Апабаепа наг(аб(1(з.
Разную концентрацию калия создают соответствующим разбавлением буферной смеси. РАБОТА 2. ВИДОВАЯ СПЕЦИФИКА ПОГЛОЩЕНИЯ НИТРАТА ВЫСШИМИ РАСТЕНИЯМИ Нитраты — основная доступная растениям форма минерального азота среды. Давно известно, что использование растениями 5)Ов — среды зависит от вида: так, Сйепород!ит, рапс, тыква, гречиха сильнее «любят» нитраты по сравнению с соей, рисом, просом или льном. Под генетическим контролем находятся раз- 134 ные этапы ннтратного обмена растений, Активность нитратредуктазы значительно различается в зависимости от вида, органа, периода развития растения.
Печально знаменитыми стали в последнее время пскоторыс овощные культуры питратоиакопители: белокочанная капуста, огурец, тьсква, морковь, картофель и многие другие. Установлены различия по кинетическим параметрам (К и амик,) поглощения нитрата между видами и даже между сортами. Интегральным результатом этих различий на молекулярно-биохимическом уровне, определяемом геномом, является разная способность видов использовать х(Ов средьд Измеряя изменение концентрации нитрата в растворе за заданный промежуток ввемснн, можно рассчитать нетто-поглогцение ьчОв, которое является результатом двух одновременно идущих процессов: потока аннана из среды в корень ((пПпх) и его выхода из корня в омывающий раствор (еП!цх).
У здоровых растений нормального соленого статуса регуляция поступления иона осуществляется через систему вход(выход на уровне цело. го растения. И'меняться может кяк величина входа, так н величина выхода, Полученные в пос, еднее время экспериментальные данные показыва1от, что кинетические характеристики поглощения ЯО,— относятся непосредственно к системе входа. Механизм работы системы выхода пока остается неясным; в количественном выражении он достигает половины от величины потока внутрь. Регистрируя нетто-поглощение (ь!Ов- у растений разного вида, но одного возраста, помещенных в одинаковые условия, можно составить представление об пх способности потреблять окнсленный азот среды. Следует помнить, что измерение изменения нетто-потока в ответ на меняюц!неся условия среды (освещенность, температура, сопутствующие ионы) выявляет интегральный ответ со стороны целого растения, расшифровка которого требует постановки специальных экспериментов.
Цель работы. Определить с помощью х)Ов-ИСЭ нетто-погло1цение нитрата кукурузой, тыквой, подсолнечником; сравнить поглощение ь)Ов — подсолнечником на светУ и в темноте. Реактивы и оборудоввние: рвстворы солей для питательной смеси (см. вадвча 1 данного раздела] калибровочные растворы КГЧОз в концентрациях 10-', 10-', 1О '. 10 4 М; 5 те-й раствор Не50и 0,1 н, раствор КОН; ионометр И-120М; ХОмИСЭ; стаканы объемом 100 мл; весы электрические ВЛКТ-500г-М Объект исследования: 10 — 20-дневные растения кукурузы, тыквы, цодсолиечиикв одного возраста, выращенные в одинаковых условиях температуры и освещения на Растворе 0,1 и.
иитательной смеси Киоиа (см. задачт 1). Присутствие ионов нитрата в среде цоя выращивании является обя- ВетЕЛЬНЫМ дЛя ИидуКцнн СИСТЕМ ИОГЛОщЕНИя ЫОе Ход работы. Готовят 3 л свежего раствора Кнопа, используя исходные растворы солей, входящих в состав смеси. В мерную колбу объемом 3 л наливают 2 л водопроводной воды, добавляют по 3 мл Са ()х)Ов)гь КНеРО„, МдЯОм )х)Н4)х)Ов, КС1 и до- 13$ водят до метки Раствор аэрнруют воздухом в течение 5 — 10 мин и проверяют рН, который должен быть в пределах 6 — 7. Прн необходимости для доведения рН используют растворы Нз504 и КОН. Для каждого вила растений берут по 3 стакана.
В них вали. вают по 50 мл питательного раствора и помещают по 4 — 5 растений Корни предварительно промывают в свежем питательном растворе. Стаканы с растениями взвешивают и оставляют па свету в течение 2 — 3 ч. Порядок работы с ИСЭ и цифровым ионометром И-120М Подготовка электродов к работе. 1. Залить внутренние растворы: для !ЧОз-ИСЭ вЂ” О,! М КгзОз+ 0.0! М КС1; для К-ИСЭ— 0,1 М КС1; для ИНеИСЭ вЂ” 0,1 М к(НзС!. Ввинтить вспомогательный электрод 2.
Поместить электроды на 24 ч в те же растворы, что залиты внутрь (их же используют для хранения электродов). Калибровка электродов, Подсоединить ИСЭ и электрод сравнечия к 1гонометру. Включить прибор и прогреть его в течение 5 мин. Промыть электроды дистиллированной водой, просушить фильтровальной бумагой и начать измерения от меньших концентраций к большим, снимая показания прибора в милливольтах. Между этими измерениями электроды не промывают, а только просушивают фильтровальной бумагой. Если электродная функция 5 находится в пределах от 47 до 62 мВ н в интервале и, меняемых концентраций наблюдается линейная зависимость ЭДС от логарифма концентрации, то электрод пригоден к работе, При работе с растворами сложного ионного состава калибровку желательно проводить на фоне исследуемого рпетвора В конце экспозиции стаканы с растениями опять взвешивают.
Разница по сравнению с предыдущим взвешиванием отражает интенсивность транспирации. Растения вынимают, корни обсушивают фильтровальной бумагой. Определяют сырую массу разных органов: корней, листьев, стеблей. Результаты записывают в виде произвольной таблицы. С помощью ИСЭ определяют активность ЬзгОз в растворах до и после экспозиции. По формуле рассчитывают концентрации ХОз и вводят поправку на уменьшение объема за счет транспирации. Зная начальную и конечную концентрации )ЧОз, вычисляют скорость нетто-поглощения иона в микромолях 1чОз на 1 г сырой массы корней за 1 ч и микромолях к)Оз — на одно растение за 1 ч.
ЗАДАЧА 3. ИЗУЧЕНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ФУНКИИИ КОРНЕИ НА ПРИМЕРЕ УСВОЕНИЯ ОКИСЛЕННОГО АЗОТА СРЕДЫ Азот — один из четырех элементов органогенов. Расчеты показывают, что за год растения земного шара выносят из поч- 136 з тз 137 ны 10'о т азота (для сравнения: в результате азотфиксации они получают 17,5 10' т). Основнымн доступными растению формами азота почвы являются ИОз — и гсН4о. Почвенные нитраты находятся в водной фазе, а ионы аммония адсорбируются на отрицате,льна заряженных почвенных частицах Поэтому поглощение Г4Нзз осуществляется корнями по мере роста и проникновения в новые слои почвы, а ионы ХОз движутся к корневой поверхности с водным током.
Соотношение окисленной и восстановленной форм азота в почве варьирует. Однако часто, в силу высокой активности почвенных нитрификаторов, особенно на хорошо аэрируемых не очень кислых почвах, основной доступной растениям формой азота являются нигрпгы. Поступив в растение, нитраты либо восстанавливаются и включаются в состав органических соединений, либо накапливаются в тканях и служат запасной формой азота.
Лееимилягорное восстановление (з!Оз включает в себя два этапа: двух- электронное восстановление нитрата в нитрит, катализируемое нитрптредукгпзой (НР), и шестиэлектронное восстановление витрита до аммония, каталнзируемое нитритредунтазой (НиР). Скорость второй реакции в 5 — 20 раз выше, поэтому при благоприятных условиях нитриты практически не накапливаются в тканях. Аммоний токсичеп, но он также не накапливается, а быстро включается в первичные реакции амидирования и аминирования. Реакция, катализируемая НР, самая медленная в цепн превращений атома азота от окисленного состояния до положения в составе органических соединений, и, следовательно, именно этот этап лимитирует скорость процесса в целом. В растительных тканях нет альтернативных путей восстановлений ХОз до ХОз .
Поэтому по активности НР можно судить об интенсивности усвоения нитратного азота. Ассимиляция нитрата у высших растений идет как в надземных органах, так и в корнях. Создание учения о биоеинтегической функции корней наряду с поглощением воды и минеральных элементов — заслуга выдающегося ученого Д. А. Сабинина (1949). Согласно современным представлениям, редукция нитрата — наиболее важная нз восстановительных реакций, протекающих в корнях. В зеленых тканях 2 электрона поступают от окисления углеводов и 6 электронов — из ЭТЦ фотосинтеза через ферредоксин. В корнях все 8 электронов образуются за счет окисления углеводов предположительно в пентозофосфатном дыхательном цикле.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
