С.С. Медведев - Физиология растений (PDF) (1134225), страница 36
Текст из файла (страница 36)
Механическое взаимодействие клеток в ходе их развития приводит к натяжению (или сдвигам)клеточных мембран, активации механочувствительных каналов и появлению векторизованных ионных потоков, которые осуществляюг уже непосредственную регуляциюпроцессов роста и дифференцировки.5.2.4.Использование мембранных везикул для изучениямембранного транспорта ионовМембранную фракцию из клеток растений, обогащенную, например, фрагментамиплазмалеммы, получают путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.Особенностью мембранных препаратов, полученных таким образом, является способность фрагментов мембран самопроизвольно замыкаться в везикулы.
При этом частьвезикул может иметь нормальную ориентацию, а дРугая их часть - инвертированную.С помощью осмотического шока везикулы плазмалем11.1Ы могут быть заполнены средой,состав которой определяется задачами эксперимента.Для количественной оценки интенсивности ионных потоков через мембрану используют флуоресv,енmнЪtе зондЪt. В зависимости от конкретных задач применяют красители ,принадлежащие к трем основным группам зондов:потенv,иа.л:ч,увствителъuЪtе,изменяющие флуоресценцию при изменении разности потенциалов на везикулярноймембране (аурамин, оксонолы, карбоцианины и дР.), рН-зависи.м:ые, реагирующие изменением флуоресценции на изменение градиента концентрации ионов водорода( акридины), и, наконец, зонды, чувствительные к изменению концентрации какого-либоиона, например '1\:алъv,ия (квин-2, фура-2, индо-1 и дР.).На рис.
5.12 приведены результаты анализа АТР-зависимого транспорта ионов Са 2 +на везикулах плаз~1алемiны, которые были получены методом дифференциального центрифугирования из клеток колеоптилей кукурузы. Внутри везикул содержался кальций-чувствительный флуоресцентный зонд индо-1, загруженный с помощью осмотического шока.
При добавлении к везикулам ионов Са2+ (10 мкМ) и комплекса Mg-ATP(3 мкМ)происходило постепенное увеличение флуоресценции зонда, что указывает напоступление ионов Са2 + внутрь везикул.Рис . 5.12. Активный трансnорт ионов Са2 +в везикулы плазмалеммы клеток колеоптилейкукурузы.Стрелкой по казан момент внесения АТРилиADP (2)(1)в инкубационную среду, содержащую2ноны Са + и везикулы плазмалеммы , загруженныефлуоресцентным зондом индо-1 .5.2.5.оМетод петч-кламп регистрации ионного транспортаПоявление метода петч-кламп(patch-clamp),который позволяет осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы, в корне изменило методологию исследований электрических159процессов и мембранного транспорта.
Появилась реальная возможность измерять токи и потенциалы в очень небольтих клетках(3-10мкм), регистрировать токи черезодиночные ионные каналы величиной в несколько пикоампер, проводить многие исследования в рамках традиционных электрофизиологических подходов .Впервые метод петч-кламп регистрации ионных токов был введен в исследовательскую практику в(Е.Neher)1976г., когда в журналеи Берта Сакмана (В.Sakmann)Natureпоявилась работа Эрвина Нейера<<Токи через одиночные каналы в мембраневолокна денервированной мышцы лягушки». Общедоступным же этот метод стал только после выхода в1981г. классической работы О . Хэмилла с коллегами(0. Р.
Hamillе. а.) <<Усовершенствованный метод петч-кламп регистрации с высоким разрешениемот клеток и фрагментов клеточных мембран». В1991г. Э . Нейеру и Б . Сакману былаприсуждена Нобелевская премия по медицине и физиологии.Основой для создания метода петч-кламп в его современном виде послужило обнаружение того факта, что при определенных условиях клеточная мембрана формируетнеобычайно плоm'Н:ый 'lшнта-к;т с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода.При небольтом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом формируется контакт, имеющий гигаомное сопротивление.
В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрируемого сигнала уменьшается на несколько порядков. Контакт мембраны со стеклом механически очень прочен, поэтому находящийся под кончиком электрода фрагмент можнолибо изолировать от клетки , либо разрушить.Существует несколько вариантов метода петч-кламп (рис .5.13).Ионные токи черезнебольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью стеклянных пипеток, у которых диаметр кончика сравнИм с размерами фрагментов. Средняя площадь отверстиякончика пипетки варьирует от 1 до 8 мкм 2 . Наружная поверхность кончиков электродовизолируется хорошо прилипающим к стеклу гидрофобным материалом - силгардавойрезиной . Особенностью незастывшего силгарда является его способность растекатьсятонкой пленкой по поверхности стекла .
Поскольку высокоомные контакты образуютсятолько с чистым стеклом, эту пленку необходимо удалять оплавлением электродов.Электронная схема для петч-кламп регистрации должна иметь такие параметры,чтобы было возможно зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких сотенon-ceiiwwhole-ceiiу1\\!!~Рис .1fj~\-~inside-out5.13.Способы измерения ионных токов методом петчкламп регистрации .v.outside-outon-cell - на м икраучастке (ограниченном кончиком микропипетки) с прикрепленной клеткой (cell-attached) ; whole-cell - oт целой клетки в условиях плотного контакта;щена внутрь пипетки ;ращена наружу.160inside-out -на изолированном участке мембраны , внешняя поверхность которой обраoutside-out- внешняячасть мембраны обэлементарных электрических зарядов через малый участок клеточной мембраны.
Измерительная аппаратура должна иметь максимально сниженные собственные шумы,не превьпuающие естественные токи.Несмотря на то, что метод петч-кламп исходно был разработан для регистрациитоков через одиночные каналы, он может быть с успехом использован для измерениятоков от целой клетки, особенно когда ее размеры невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить, прикладываяк ней короткие импульсы отрицательного давления. Часто такая манипуляция не нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате междУ электродом и цитоплазмойустанавливается хорошо изолированный от внешней среды проводящий путь. Такойспособ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введениестандартного I\ШКроэлектрода.При измерении мембранных потенциалов с помощью классической микроэлектродной техники большая часть клеток диаметром менее20 мкмповреждается.
Метод петчкламп позволяет успешно регистрировать мембранный потенциал клеток диаметром10 мкм,не разрушая их (рис . 5.14). Сопротивление утечки микроэлектрод-клетка прииспользовании обычных микроэлектродов не превышаетпротивление утечки приwhole-cell500МОм, в то время как сорегистрации может достигатьесли сопротивление кончика обычного микроэлектрода(Rs)20ГОм. И, наконец,составляет болеето сопротивление кончика пипетки при плотном контакте равно4100 МОм,МОм. Поэтому метод регистрации при плотном контакте имеет ряд явных преимуществ по сравнению сдругими методами.баRs=IOOРис .5.14.МОмМетоды регистрации мембранного nотенциала и ионных токов (Марти, Неер ,а - обычная микроэлектродная техника; б- петч- кламп регистрация от целой клеткиплотном1987).{whole-cell)nриконтакте .Однако наиболее корректную информацию о мембранной проводимости все-такидает регистрация токов через одиночные каналы, поскольку позволяет избавиться отряда артефактов, которые могут быть получены при регистрации макроскопического тока.
При этом появляется возможность измерить амплитуду тока через открытыйканал, различать токи, проходящие через каналы разной проводимости . По записям токов через одиночные каналы можно получать информацию о кинетике работы канала,которую нельзя извлечь из макроскопических измерений . Это преимущества особенноочевидно при регистрации на фрагментах мембран, содержащих только один канал.1615.3.АССИМИЛЯЦИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ИОНОВ РАСТЕНИЯМИАсси.мил.я:циеi1 называют процесс включения минеральных элементов в органические соединения.
Для ассимиляции минеральных элементов (особенно азота и серы)необходим целый комплекс биохимических реакций, в том числе и с затратой энергии.Например , в ходе редукции NОЗ до NHt расходуется 12 молекул АТР, в ходе фиксацииN2требуется16 молекулАТР для восстановления одного атома азота, а на пути отSO~- до цистеинарасходуется 14 молекул АТР. Процесс ассимиляции ряда других элементов, особенно Са2 + , 1fg2 + и микроэлементов, включает формирование комплексов,вкоторых металлысвязываются сорганическимисоединениямикоординационнымисвязями с образованием хелатов . Эти металлоорганические комплексы очень стабильны и при удалении металла теряют свои функции.5.3.1.Ассимиляция азотаЖивые организмы различаются по способности ассимилировать различные формы1азотистых соединений .
1fикроорганизмы способны усваивать молекулярный азот, рас-тения могут использовать лишь ыинеральные формы азота, а животные-только азqторганического происхождения . У растительных организмов первичное включение азотав аминокислоты происходит только в аммонийной форме. Именно с аммония начинается азотный обмен растения, аммонием он и завершается . Поэтому Д. Н.
Прянишниковназвал аммиак <<альфой и омегой азотного обмена».Превращение азота в почве микроорганизмами. При возделывании сельскохозяйственных культур запасы азота в почве можно пополнить за счет минеральныхудобрений . В естественных же условиях это осуществляется различными группаrvшмикроорганизмов, одни из которых способны превращать недоступный для растенийорганический азот в форму NHt и NОЗ, а другие связывают молекулярный азот атмосферы. Фундаментальные исследования биологических процессов, происходящих впочве с участием микроорганизмов , были проведены С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
