П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (1134216), страница 75
Текст из файла (страница 75)
Трансформированные клетки можно аналогично протопластам выращивать до каллусов на гормональной питательной среде в присутствии селективного фактора, в то время как нетрансформированная ткань на такой среде отмирает.Т а б л и ц а А. Примеры чужеродных генов,которые применяют для трансформациирастенийПродукт генаСфера использования генаНеомицинфосфо- Селекция трансгенныхтрансфераза (NPT) растений (устойчивость(канамицинкиназа) к антибиотикам)ХлорамфениколСелекция трансгенныхацетилтрансфераза растений (устойчивость(CAT)к антибиотикам)Фосфинотрицин- Селекция трансгенныхацетилтрансфераза растений (устойчивость(PAT)к гербицидам)p-D-глюкуронида- Репортер генной активности (гистохимическийза (GUS)цветной тест)Зеленый флуоресцирующий белок,(GFP)Репортер генной активности (прямое визуальное доказательствотрансформации in vivo)Рис.
D. Регенерация побегов табака из листового каллуса.Пересадка каллуса на питательную среду сповышенной концентрацией цитокинина и пониженной концентрацией ауксина индуцирует процесс регенерации побеговИз каллусов снова регенерируют целые растения (рис. D). Чтобы начать трансформацию клеток с помощью Agrobacterium, часто достаточно начавший цветение побег Arabidopsis thalianaпогрузить на короткое время в суспензию бактерий (инфильтрировать), создать вакуум. Еслипри этом трансформируются те клетки меристемы цветка, которые ответственны за образование семяпочек, то после опыления и оплодотворения наряду с нетрансформированными возникают также трансформированные семена, которые развиваются в присутствии селективного фактора (в нашем примере, канамицина), в то время как нетрансформированные семена погибают.
Благодаря самоопылению(Arabidopsis thaliana является самоопылителем)получают гомозиготные трансформированныерастения (см. рис. 7.1).• Далее следуют генетическая, биохимическая и физиологическая характеристика регенерированных трансгенных растений и при необходимости дальнейшая селекционная работа.Здесь мы рассмотрели лишь некоторые технические подробности этого процесса. Дальнейшую информацию можно получить из учебников по молекулярной генетике или молекулярной биотехнологии.ЛитератураGlick BR, Pasternak JJ (1995). MolekulareBiotechnologie. Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg.Kempken F, Kempken R (2000). Gentechnikbei Pflanzen. Springer, Berlin.7.2.
Генетические основы развития |249л^^^^^^^м^^^м^^^^^^^^^в^^^Трансгенные растения уже много лет имеют фундаментальное научное значение. Крометого, в последние годы они находят все большее применение в сельском хозяйстве, послетого как трансгенные культурные растениявпервые поступили на рынок в США в 1995 г.Разнообразные области применения трансгенных растений проиллюстрируем несколькимипримерами.
Они охватывают среди прочего:• Повышение экспрессии (гиперэкспрессия) собственных генов вида, например путем применения более активных промоторов(особенно 35S-npoMOTopa вируса мозаикицветной капусты, см. 9.3.2, бокс 9.1).• Снижение экспрессии собственных геноввида, например путем антисенс-косупрессии.При этом копия гена, который нужно исследовать (или соответственно его кДНК), соединяется в обратном направлении с подходящимпромотором (например, 358-промотором вируса мозаики цветной капусты), и эту конструкцию, как описано, вводят в геном, так чтопри транскрипции гена ДНК-зависимой РНКполимеразой II считывается кодирующая, а нематричная (транскрипция, рис.
7.11, А) цепь.Из-за этого образуется мРНК, которая комплементарна матричной цепи. Но она одновременно комплементарна мРНК, которая производится в клетке в результате транскрипции правильно ориентированного гена, и поэтому называется «антисмысловая» мРНК(англ. «antisense»-mRNA). КомплементарныемРНК образуют, вероятно, двухцепочечныемолекулы РНК, которые расщепляются специфическими для двойной цепи РНКазами.Из-за этого «смысловая» мРНК (англ. «sense»mRNA) удаляется из клетки и больше не пригодна для трансляции. Первое трансгенноекультурное растение, поступившее на рынок, — томат с более твердыми плодами, который получил свое специфическое свойствос помощью антисенс-косупрессии.
Благодаряэкспрессии «антисмыслового» гена полигалактуроназы в плодах сильно уменьшалось образование этого фермента и тем самым сильноуменьшалось растворение состоящих большейчастью из полигалактуроната (пектина) срединных пластинок, которое происходит вовремя созревания плодов и вносит вклад в размягчение плодов.• Экспрессия чужеродных для вида генов врастении, например для введения устойчивости к болезням или для получения измененного или нового продукта обмена веществ.Среди прочего есть попытки достичь сбалансированного питания при чисто растительной диете благодаря экспрессии чужеродныхгенов, кодирующих белки с более подходящим для питания человека составом аминокислот в семенах. Недавно удалось ввести врастения риса гены полного пути биосинтезаР-каротина (рис.
А) и добиться их экспрессии в эндосперме. Получение трансгенногориса с высоким содержанием р-каротинапредставляет собой веху в борьбе с дефицитом витамина А, особенно распространенныму детей в населении таких стран, где рис является основным источником питания (р-каротин = провитамин А).• Исследование контроля транскрипции растительных генов.
Для этого промотор,который нужно исследовать, присоединяют ккодирующей части легко детектируемого гена,который называют также репортерным геном(или соответственно с кДНК, которая включает кодирующую область такого гена)Рис. А. Синтез р-каротина в эндосперметрансгенных зерновок риса (с любезного разрешения I.Potrykus, P.Beyer).Экспрессия генов фитоенсинтазы, фитоендесатуразы и ликопинциклазы ведет к образованию более чем 1 мг • кг"1 р-каротина в крахмалистом эндосперме (темно-серая окраска!)трансформированных этим геном растенийриса (агробактериальная трансформация, см.боксы 7.3, 9.2). Рис дикого типа не образует вкрахмалистом эндосперме р-каротин, зерновки кажутся бесцветными2 5 0| ГЛАВА 7.
Ф И З И О Л О Г И Я РАЗВИТИЯоСН2ОНО-С о-Рис. В. Гистохимическая реакция на (3-глюкуронидазную активность.5-Бром-4-хлор-3-иднолил(S-D-глюкуронидН20^^fi-D-глюкуронидазаС!p-D-глюкуроноваякислотаCIОНВгВ присутствии 0 2 происходят самопроизвольное окисление и димеризация образовавшегося индоксила до красителя индиго. Добавление гексацианоферрата (III), [Fe(CN)6]3", ускоряет эту реакцию.
5-Бром-4-хлор-3-индолильный остаток находит применение также вгистохимических реакциях на наличие другихгидролаз, например р-галактозидазы (соединенной с p-D-галактозой) и фосфатазы (соединенной с фосфатом)ВгN ТаутомерияIН5-Бром-4-хлориндоксил[Fe(CN)6f- [Fe(CN)6]4-^Окисление,димеризация5,5'- Дибром - 4,4'- дихлориндиго(нерастворимый синий краситель)(см. бокс 7.3, табл. А), и эту'генную конструкцию вводят в геном растения, которое нужно исследовать. Активность промотора и егорегуляцию в трансгенном растении можнозатем анализировать благодаря тому, что образующийся генный продукт легко обнаружить.Часто в качестве репортерного гена используется ген р-глюкуронидазы uidA из Escherichiacoli, который можно обнаружить гистохимически (рис. В —D), или ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP)1 из морской медузыAequorea Victoria.
Белок GFP, возбужденныйосвещением коротковолновым синим светом,флуоресцирует зеленым светом. Поэтому GFP1От англ. Green Fluorescent Protein — зеленый флуоресцирующий белок. — Примеч. ред.7.2. Генетические основы развития |251>Рис. D. Анализ регуляции активности промотора факторами внешней среды (с любезногоразрешения I.Kubigsteltig).Катализирующий раннюю реакцию биосинтеза жасминовой кислоты фермент алленоксидсинтаза регулируется многочисленными факторами (см.
7.6.6.2, рис. 7.66), которые оказывают влияние на эффективность транскрипции гена алленоксидсинтазы. Активацию промотора алленоксидсинтазы при ранении можно показать в трансгенных растениях, которыеэкспрессируют р-глкжуронидазу под контролем промотора алленоксидсинтазы. Ранение{стрелка) вызывает через несколько часовсильную локальную активацию промотора,обнаруживаемую по сильной р-глюкуронидазной активности (показано растение табака,которое через 4 ч после ранения подверглигистохимическому анализу на р-глюкуронидазу). Одновременно активируется промоторвдоль проводящих путей; эта активация быстро распространяется в проводящей тканирастения, а также переходит в неповрежденные ткани. При этом происходит системнаяиндукция.
Она является следствием распространения в растении раневого фактора, индуцирующего активность многочисленных геновзащиты (см. 9.4.1). У томатов это короткийпептид системин (см. рис. 9.19), у других видовструктура раневого фактора еще не выяснена<Рис. С. Анализ тканеспецифичности промотора (с любезного разрешения N.Sauer):1 — гистохимическая реакция на наличие р-глюкуронидазы (синее окрашивание, реакция; см.рис. В) показывает активность промотора белка-транспортера сахарозы SUC2 (англ.
sucrose —сахароза), специфичного для клеток в проводящих пучках Arabidopsis thaliana. В самых молодыхлистьях, которые являются акцепторами сахарозы, активность не выявляется; в листьях, которыесодержат как ткани-доноры, так и ткани-акцепторы фотоассимилятов, SUC2-npoMOTOp в кончикелиста (донорная область) активен, в листьях-донорах активность выявляется во всех проводящихпучках листа. Такой характер экспрессии позволяет предположить, что SUC2 участвует в загрузке флоэмы. Анализы промотора и репортерного гена, хотя и говорят кое-что о генной активности, не позволяют сделать вывод, действительно ли образуется соответствующий белок в ткани,которая демонстрирует генную активность; 2 — локализация ЭиС2-белка в проводящих клеткахбыла показана путем маркирования белка специфичными антителами с флуоресцентной меткойи последующего микроскопического анализа (наложение микрофотографий поперечного срезалиста в проходящем свете на снимки того же препарата при флуоресценции).
Интенсивно излучающие зеленый свет области показывают иммунофлуоресцию 811С2-белка в клетках флоэмы.Дополнительно проявляется более слабая желтая автофлуоресценция лигнифицированных клеточных стенок в области ксилемы. В продольном срезе через ось соцветия 3 можно отличитьклетки-спутницы по их удлиненной форме и клеточному ядру от безъядерных ситовидных элементов (ДНК была помечена флуоресцирующим красителем DAPI — 4,6-диамидино-2-фенилиндолом, голубое свечение).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
