П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (1134216), страница 76
Текст из файла (страница 76)
311С2-белок, узнаваемый по зеленой флуоресценции антител, выявляется в клетках (Флоэмный транспорт; см. 6.8, рис. 6.72)252| ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ440 нм480 нмСа'^ГСа*Рис. Е. Технология резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET)для исследования изменений цитоплазматического уровня кальция в замыкающих клетках после обработкифитогормоном абсцизовой кислотой(АБК) (1 — по R. Tsien, с изменениями;2 — по G.Allen, J.Schroeder, с любезного разрешения):1 — принцип метода. Трансгенные растения Arabidopsis thaliana экспрессируютхимерный ген, открытая рамка которого состоит из 4 частей, кодирую440 нм535 нмщих белок с 4 связанными друг с другом функциональными доменами.В клетке этот белок действует как детектор кальция: CFP (отангл.
cyan fluoresent protein); CAM (кальмодулин);M13 (пептид, связывающийся с кальмодулином в присутствии ионов Са2+);YFP (англ. yellow fluoresent protein).CFP и YFP — полученные путем генныхмутаций производные имеющегося вAequorea GFP (см. текст) с измененными спектрами поглощения и излучения;кальмодулин — Са2+-связывающий белок с 4 местами связывания для ионовСа2+.
При низких концентрациях Са2+ вклетке кальмодулин находится в бескальциевой форме и химерный детекторный белок обладает открытой структурой. Если клетку освещают синимсветом с длиной волны 440 нм, то возбуждается только CFP, и происходит1015флуоресценция света с длиной волныВремя, мин480 нм (синий — cyan). Если в клеткеповышается концентрация кальция, Са2+ связывается с кальмодулином, а пептид М13 ассоциируется с Са 2+ -САМ-комплексом. Тем самым YFP-домен оказывается в непосредственной близости к CFP-домену. В этой форме CFP при возбуждении светом с длиной волны 440 нм не флуоресцирует, а переносит свою энергию возбуждения без излучения на YFP, который излучает ее, всвою очередь, в виде флуоресценции с длиной волны 535 нм (желтый); в этом случае говорят орезонанном переносе энергии флуоресценции (FRET).
Измеряя соотношение флуоресценциипри 535 и 480 нм, можно рассчитать концентрацию ионов Са2+ в цитоплазме; благодаря высокоразрешающей микроспектральной фотометрии можно визуализировать распределение ионовСа2+ в клетке;2 — FRET-анализ цитоплазматической концентрации Са2+ ([Са2+]ср) в замыкающих клетках устьиц у трансгенных растений Arabidopsis thaliana после добавления АБК (10 мкМ). На фотографияхпоказано распределение ионов Са2+ в клетках в определенные моменты времени; на графикепоказана зависимость соотношения интенсивности излучения света при 535 нм:480 нм от времени (среднее значение для двух показанных замыкающих клеток). Анализ показывает, что индукция закрытия устьиц при обработке АБК сопровождается периодическим повышением внутриклеточного уровня кальция в замыкающих клетках (движение замыкающих клеток; см. рис. 8.33)особенно подходит для исследования активностигеноввживыхклетках.• Исследование молекулярных процессов вживой клетке.
Для этого чаще применяют так-7.2. Генетические основы развития [ 2 5 3же зеленый флуоресцирующий белок (GFP)из Aequorea или варианты этого белка с измененными спектрами возбуждения или соответственно флуоресценции. Для исследованиясубклеточной локализации белков используютхимерные гены, у которых до или после области кодирования гена, который нужно исследовать, кодирующая последовательность дляGFP поставлена так, что возникает непрерывная рамка считывания.
Транскрипция этойрамки считывания дает одну-единственнуюмРНК, а ее трансляция — химерный белок сGFP, соединенным с N- или С-концом белка, который нужно исследовать. Внутриклеточное распределение химерного белка можно наблюдать под микроскопом по флуоресценции GFP в живой клетке, можно дажепроводить видеосъемку в режиме реальноговремени.
Таким образом, можно следить прямо под световым микроскопом, например, задинамикой цитоскелета или за везикулярнымпотоком в клетке.Особенно хорошо разработан метод с использованием трансгенных растений, синтезирующих состоящие из нескольких доменовмодульно построенные белки-детекторы, спомощью которых можно селективно и оченьчувствительно визуализировать и даже количе-цепочечного разрыва ДНК, и предотвращает объединение хромосом во время репарации ДНК. Кроме того, теломеры имеют значение для правильной репликацииконцов хромосомы. Специфические белкизакрепляются в интерфазном ядре на теломерах и на ядерной оболочке. На центромерах при клеточном делении образуются кинетохоры, с которыми соединяютсямикротрубочки веретена деления (см.
бокс2.2). У хромосом некоторых немногочисленных видов (например, Luzula, см. 11.2)нельзя локализировать центромеры: здесьнити веретена могут присоединяться комногим участкам хромосом, тогда говорято «рассеянных» центромерах. Тандемно расположенные повторы последовательностейхарактеризуют также некодирующую инеизвестную по функции сателлитнуюДНК, названную так, потому что при центрифугировании фрагментов ДНК в градиенте плотности хлористого цезия из-заотличающегося состава нуклеотидных оснований и соответственно из-за немногоственно оценить динамические изменения концентрации определенных ионов в клетке (например, ионов Са2+). Кальций является центральным регулятором обмена веществ клетки.
Концентрация Са2+ в цитоплазме составляет лишьоколо 0,1 мкмольл 4 , однако может в ответна многие стимулы временно повыситься донескольких мкмольл"', например, в замыкающих клетках после воздействия фитогормоном абсцизовой кислотой (см. 8.3.2.5, рис. 8.33).За этим процессом можно напрямую следить спомощью показанной на рис. Е технологииFRET (нем. Fluoreszenzresonanzenergie-Transfer,резонансный перенос энергии флуоресценции).Хотя трансгенные растения давно стали незаменимым вспомогательным средством исследований, их возделывание вызывает опасенияу общественности прежде всего в Центральной Европе, в то время как в Америке, Австралии и Азии уже с середины 90-х гг. XX в.они используются в сельском хозяйстве.ЛитератураKempken F, Kempken R (2000).
Gentechnikbei Pflanzen. Springer, Berlin.изменившейся равновесной плотности этаДНК появляется в форме сопутствующихполос (сателлитов) вблизи основных полос ДНК — не путать с морфологическиопределенными сателлитами по соседствус областями ядрышкового организатора (см.2.2.3.3, рис. 2.25). Расположенные в областях ядрышкового организатора гены рибосомальных РНК (рРНК) представлены более чем 20 000 копиями на геном в виде тандемных повторов практически идентичныхпоследовательностей генов и идентичныхмежгенных областей.
Однако гены робосомальной РНК сосредоточены в одной илинескольких хромосомах (см. бокс 7.1).Среди расположенных разрозненно вядерном геноме диспергированных повторяющихся участков ДНК особенно важнытранспозоны и ретротранспозоны. В обоихслучаях речь идет о мобильных генетических элементах, которые меняют свое расположение в геноме со сравнительно высокой частотой или соответственно интегрируются при репликации в дополнитель-254| ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯные места в геноме. Транспозоны характеризуются короткими обратными повторами последовательности на своих границах,которые необходимы для транспозиции.1Автономные транспозоны (например,транспозон Ас кукурузы) несут дополнительно по крайней мере один ген, который необходим для транспозиции и кодирует транспозазу; другие транспозоны (например, Ds-элементы кукурузы) нуждаются для транспозиции в автономном транспозоне, так как они больше не обладаютполной внутренней кодирующей областью.Ac-Ds-элементы кукурузы были первымиоткрытыми В.
McClintock в 1940—1955 гг.мобильными генетическими элементами.В отличие от транспозонов ретротранспозоны перемешаются через промежуточныйпродукт РНК, который транскрибируетсякодируемой самим транспозоном обратнойтранскриптазой в к-ДНК (англ. copy-DNA,cDNA). Эта ДНК-копия может интегрироваться в геном в другом месте. Для этогослужат длинные прямые повторы (LTR,англ.
long terminal repeats), которые лока1Эта особенность характерна для транспозонов, перемещающихся в геноме нерепликативно. При транспозиции последовательностьтранспозона вырезается из одного участка генома и перемещается в другой. Нерепликативные транспозоны представлены малым числомкопий на геном. — Примеч. ред.лизованы на концах ретротранспозона (илисоответственно кДНК).
Механизм транспозиции имеет большое сходство с процессом размножения у ретровирусов. Ретротранспозоны могут составлять значительную часть ядерного генома, у кукурузы —почти 50 %.7.2.1.2. Пластидный геномВ отличие от ядерного генома субгеномпластид — пластом — находится в формекольцевой замкнутой молекулы ДНК(плДНК). В зависимости от степени развития фотосинтетического аппарата у хлоропластов имеется 20—200 идентичных копийплДНК на органеллу.
Как у прокариот, молекулы ДНК находятся в нуклеоидах. Хлоропласты содержат 10 — 20 нуклеоидов, прикрепленных к мембране тилакоидов иливнутренней мембране оболочки и содержащих 2 — 20 молекул плДНК каждый. Пластиды, таким образом, полиплоидны и полиэнергидны. Так как клетки в ассимилирующей ткани листьев могут содержать более 100 хлоропластов, то в одной такой клетке имеется около 10 000 копий пластома.Пластомы низших и высших растенийимеют похожий размер.
Они включают чащевсего 130—150 тыс. п.н.1 (см. рис. 7.5; 7.4)1В иностранной литературе применяют наименование килобаза (kb, kbp). — Примеч. ред.Рис. 7.5. Генетическая карта пластидной ДНК табака (Nicotiana tabacum) (с любезного разрешенияRWesthoff, Vorlage von G.Link).Положение и протяженность генов обозначены прямоугольниками; гены, названия которых написаны внутри кольца, транскрибируются по часовой стрелке, гены, названия которых написаны снаружи, — против часовой стрелки. Стрелки указывают на полицистронные единицы транскрипции инаправление их транскрипции.
Обозначенные символом «*» гены содержат интроны. Выделенныетолстыми линиями участки ДНК-кольца представляют собой последовательности двух больших инвертированных повторов, которые также содержат точку начала репликации (ог/А, ог/В); окружности, обозначенные тонкой линией, представляют два уникальных участка.
Номенклатура пластидныхгенов соответствует той, которая принята для прокариот (см. бокс 7.2). Некоторые важные гены илигруппы генов: psa — фотосистема I, psb — фотосистема II, pet — цитохром Ь6/^-комплекс, atp —АТФ-синтаза, r o d (от англ. Large) — большая субъединица рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы. Далее: гены рибосомальных белков малой (rps) или соответственно большой (rpl) субъединицы рибосом; кодируемая пластидами РНК-полимераза (гро), рибосомальные РНК (rrn). ГенытРНК даны в виде однобуквенного кода (см. рис. 1.11) переносимой аминокислоты, а также 5'->3'последовательности их антикодона, например H-GUG: TPHK H I S , антикодон 5'-GUG-3', но: fMet-CAU =ген тРНК, связывающей инициаторный кодон 5'-AUG-3' через его антикодон 5'-CAU-3', несущейN-формилметионин (fMet).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
