П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (1134216), страница 74
Текст из файла (страница 74)
В последующих циклах репликации хозяйская клетка образует полноценныезамкнутые плазмидные молекулы без одноцепочечных разрывов. В качестве плазмидных векторов используются производные бактериальных плазмид устойчивости, которые наряду с точкойначала репликации несут также ген устойчивости к антибиотикам. Поэтому те бактериальные клетки, которые содержат рекомбинантные плазмиды, растут в присутствии антибиотика, в то времякак нетрансформированные клетки погибают. Показанная очень простая система не позволяетвставить клонируемый рестрикционный фрагмент в определенной ориентации в плазмидном векторе.
Однако если при линеаризации плазмиды и получении рестрикционного фрагмента последовательно используют соответственно две различные рестрикционные эндонуклеазы, так, чтобы возникли различные выступы последовательностей на обоих концах, то можно достичь правильно ориентированной вставки рестрикционного фрагмента в вектор для клонирования246[ ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯшое значение для сельского хозяйства и селекции культурных растений. С середины90-х гг. XX в. трансгенные культурные растения начали возделывать на больших площадях — преимущественно в Северной Америке, Южной Америке. Австралии, а также всебольше в Азии.
Идет острая дискуссия о рисках и перспективах использования генно-инженерно модифицированных культурных растений. Прежде всего заслуживают тщательного исследования экологические последствияиспользования этих растений в мире.Создание трансгенных растений — многоступенчатый процесс. Он состоит из следующих этапов:• Выделение и точная характеристика молекулы ДНК, которую нужно перенести. При этомречь может идти об участке генома, отдельномгене или так называемой кДНК (англ.
copy DNA).кДНК образуется с помощью обратной транскриптазы в присутствии мРНК-матрицы и 2'дезоксирибонуклеотидов (см. рис. 1.4).• Конструирование вектора для клонирования, с помощью которого ген, который нужно перенести в подходящий организм, какправило, в бактериальный хозяйский штамм,можно сохранить и реплицировать в большомколичестве копий («клонирование»).
В качествевекторов для клонирования используются, какправило, производные бактериальных плазмидустойчивости (R-плазмиды, см. учебники помикробиологии). Хозяйские штаммы являются безопасными штаммами (чаще всего этоEscherichia coli), которые из-за многочисленных мутаций растут только на специально составленной питательной среде, но уже не могут расти вне лаборатории.• Конструирование вектора для трансформации (чаще речь идет о плазмиде для восприятия клонированной ДНК) и введениевектора в бактерии, способные к трансформации растительных клеток. Сегодня для трансформации растений применяется почти исключительно Agrobacterium tumefaciens, возбудитель опухолей корончатого галла (см. бокс9.2).
В качестве векторов для трансформациииспользуют производные Ti-плазмиды этойбактерии. Чаще используют плазмиды, которые реплицируются как в Escherichia coli, таки в Agrobacterium tumefaciens, и служат одновременно как векторы для клонирования и каквекторы для трансформации (рис. С). Определенная область Ti-плазмиды, область Т-ДНК(Т-ДНК = переносимая — англ. transferierred —ДНК), переносится в растительную клетку истабильно интегрируется в любом месте в ядерный геном растения (см. бокс 9.2).E.coliori,s Точка началарепликациидля множествабактерий-хозяевПравая границаТ-ДНКp35S• Трансформация растения-хозяина.
Онапроисходит при использовании Agrobacteriumtumefaciens либо путем кокультивации растительных эксплантов (например, фрагментылистьев табака) с агробактериями, либо путем вакуумной инфильтрации бактерий в семена или соответственно меристемы цветка(используется прежде всего для Arabidopsisthaliana, см. бокс 7.1). Проходящие при переносе Т-ДНК процессы подробнее рассмотрены в боксе 9.2.Для растений, которые нельзя трансформировать с помощью Agrobacterium (например,многие однодольные виды), разработаны другие способы, прежде всего трансфекция (перенос свободных от белков ДНК-молекул вклетку). Так, удается стабильно интегрироватьДНК (например, векторов) путем баллистической трансфекции («обстрел» растительныхтканей вольфрам-карбидными или золотымичастицами, на поверхность которых нанесенымолекулы ДНК); путем электропорации (кратковременное создание импульса высокого напряжения между двумя электродами, которыепогружены в раствор растительных протопластов и молекул ДНК); химическим путем (например, добавлением полиэтиленгликоля ксмесям протопластов и плазмид); путем микроинъекции (ДНК целенаправленно инъецируют в определенные клетки).• Отбор успешно трансформированных (илисоответственно трансфицированных) клеток.Это происходит при использовании соответствующих фрагментов генов, которые вводятся с помощью Т-ДНК в растительную клетку7.2.
Генетические основы развития [247<Рис. С. Строение вектора для трансформации, пригодного для клонирования в Escherichia coli, идля внедрения в Agrobacterium tumefaciens, который может использоваться для переноса Т-ДНК(см. бокс 9.2) в растения.Вектор несет признаки бактериальных плазмид устойчивости и одновременно содержит все требующиеся для интеграции в ядерный геном элементы Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacteriumtumefaciens (бокс 9.2), однако в одиночку не может вызывать трансформацию растительной клетки, так как отсутствуют существенные генные элементы полной Ti-плазмиды (например, v/r-область).
Поэтому чтобы стать способными к трансформации растений, агробактериальные штаммы должны нести вспомогательную плазмиду (так называемая хэлперная Ti-плазмида без области Т-ДНК), которая содержит генные элементы, отсутствующие у вектора для трансформации.Показанный для примера вектор несет следующие элементы: точку начала репликации для репликации плазмиды в Escherichia coli (Е. coli oriv) и точку начала репликации для репликации плазмид широкого спектра бактерий-хозяев (среди прочих Agrobacterium); ген устойчивости для селекции в бактериях-хозяевах (например, npf-ген: он кодирует неомицинфосфотрансферазу ивызывает устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину); правую и левую границы области Т-ДНК Ti-плазмиды (о структуре и функции этого участка ДНК см.
бокс 9.2). Эти пограничные участки, а также все фрагменты ДНК между ними переносятся в ядерный геном растения.Внутри области Т-ДНК находится ген устойчивости для селекции трансформированных растительных клеток (1). Часто используют уже упоминавшийся npf-ген под контролем промотора нопалинсинтазы A. tumefaciens (pnos) с сайтом терминации транскрипции гена нопалинсинтазы(tnos).
Нопалинсинтазный промотор распознается растительной РНК-полимеразой II и содержитцис-элементы, усиливающие транскрипцию (см. 7.2.2.3). Полилинкер (или «сайт множественного клонирования» MCS — от англ. multiple cloning site) (2) — это участок ДНК, который несет расположенные тесно друг с другом и даже частично перекрывающиеся последовательности узнавания для множества рестрикционных эндонуклеаз. Полилинкер пригоден для интеграции разнообразных рестрикционных фрагментов. В показанном примере в сайт множественного клонирования вносится целевой ген, который, с одной стороны, фланкирован участком терминаторатранскрипции нопалинсинтазы, а с другой стороны — промотором 35S-MPHK вируса мозаикицветной капусты (p35S; см.
бокс 9.1). Промотор 35S очень сильный и активен почти во всех растительных клетках.В показанном примере последовательность полилинкера находится внутри кодирующей областибактериального гена/acZ', перед которым помещен ген /acl. Это расположение применяется такжево многих других плазмидах для клонирования чужеродной ДНК, так как в этом случае возможноочень простое доказательство успешной вставки ДНК («бело-голубая селекция») в бактериальные хозяйские клетки. В основе метода лежит следующий принцип. Ген 1асТ несет 5'-участок кодирующей последовательности фермента В-галактозидазы бактериального гена lacZ. Подходящие бактерии-хозяева содержат в хромосомной ДНК З'-участок этого гена, но не полный ген lacZ.В присутствии кодируемого плазмидой гена /acZ' в клетке оба «неполных фермента» в-галактозидазы образуются раздельно.
Однако они могут ассоциироваться в функциональную й-галактозидазу, которую можно гистохимически выявить совершенно так же, как В-глюкуронидазу (см.бокс 7.4), с использованием субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-0-галактопиранозида (голубое окрашивание бактериальных колоний). Вставленная последовательность полилинкера выбрана так, что она не нарушает рамку считывания гена 1асТ и не мешает функционированию фермента. Однако если из-за вставленного фрагмента ДНК рамка считывания гена/acZ' нарушается,то хозяйские бактерии больше не образуют функциональный N-терминальный неполный фермент В-галактозидазы и отсутствующая В-галактозидазная активность проявляется в виде бесцветных колоний. На чашке Петри с агаром многочисленных колоний можно очень легко отличитьте, которые несут вставку ДНК (белые колонии), от тех, где ее нет (темно-серые колонии).
К томуже ген lacZ (и соответственно В-галактозидазная активность) индуцируется с помощью 1ас\. Этотген кодирует белок-репрессор, который путем связывания с промотор-операторным участкомгена /acZ' препятствует транскрипции гена lacZ до тех пор, пока к клеткам не будет, добавленIPTG — изопропилтиогалактозид. IPTG связывается с белком-репрессором, из-за чего тот покидает промотор-операторный участок гена 1асТ и может запускать транскрипцию 1асТ (о структуреи функции /ас-оперона Escherichia coli см.
учебники по молекулярной генетике или микробиологии)248| ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯи экспрессируются после встраивания в растительный геном (табл. А). Часто применяют геныустойчивости. В примере на рис. С речь идет обактериальном npt-гене, кодирующем неомицинфосфотрансферазу, которая среди прочегоинактивирует путем фосфорилирования токсичный для растительных клеток антибиотикканамицин, так что успешно трансформированные (или соответственно трансфицированные) растительные клетки в присутствии канамицина выживают, в то время как нетрансформ ированные клетки погибают.• Регенерация дифференцированных растений из отобранных клеток.
Если для трансфекции использовали протопласты, то клетки,выжившие в присутствии селективного фактора (например: канамицина), могут давать каллусную ткань на подходящей культуральноисреде с ауксином и цитокинином (см. 7.6.2.3).Из этих каллусов путем изменения соотношения ауксин/цитокинин можно регенерироватьполноценные растения в большом количестве(см. рис. 7.47). Для трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens проводят кокультивирование растительных тканей (например, листовых дисков) с бактериями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
