Главная » Просмотр файлов » П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений

П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (1134216), страница 74

Файл №1134216 П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (П. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений) 74 страницаП. Зитте, Э.В. Вайлер, Й.В. Кадерайт, А. Брезински, К. Кернер - Ботаника. Учебник для вузов. Том 2. Физиология растений (1134216) страница 742019-05-12СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 74)

В последующих циклах репликации хозяйская клетка образует полноценныезамкнутые плазмидные молекулы без одноцепочечных разрывов. В качестве плазмидных векто­ров используются производные бактериальных плазмид устойчивости, которые наряду с точкойначала репликации несут также ген устойчивости к антибиотикам. Поэтому те бактериальные клет­ки, которые содержат рекомбинантные плазмиды, растут в присутствии антибиотика, в то времякак нетрансформированные клетки погибают. Показанная очень простая система не позволяетвставить клонируемый рестрикционный фрагмент в определенной ориентации в плазмидном век­торе.

Однако если при линеаризации плазмиды и получении рестрикционного фрагмента после­довательно используют соответственно две различные рестрикционные эндонуклеазы, так, что­бы возникли различные выступы последовательностей на обоих концах, то можно достичь пра­вильно ориентированной вставки рестрикционного фрагмента в вектор для клонирования246[ ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯшое значение для сельского хозяйства и се­лекции культурных растений. С середины90-х гг. XX в. трансгенные культурные расте­ния начали возделывать на больших площа­дях — преимущественно в Северной Амери­ке, Южной Америке. Австралии, а также всебольше в Азии.

Идет острая дискуссия о рис­ках и перспективах использования генно-инженерно модифицированных культурных рас­тений. Прежде всего заслуживают тщательно­го исследования экологические последствияиспользования этих растений в мире.Создание трансгенных растений — много­ступенчатый процесс. Он состоит из следую­щих этапов:• Выделение и точная характеристика моле­кулы ДНК, которую нужно перенести. При этомречь может идти об участке генома, отдельномгене или так называемой кДНК (англ.

copy DNA).кДНК образуется с помощью обратной транскриптазы в присутствии мРНК-матрицы и 2'дезоксирибонуклеотидов (см. рис. 1.4).• Конструирование вектора для клониро­вания, с помощью которого ген, который нуж­но перенести в подходящий организм, какправило, в бактериальный хозяйский штамм,можно сохранить и реплицировать в большомколичестве копий («клонирование»).

В качествевекторов для клонирования используются, какправило, производные бактериальных плазмидустойчивости (R-плазмиды, см. учебники помикробиологии). Хозяйские штаммы являют­ся безопасными штаммами (чаще всего этоEscherichia coli), которые из-за многочислен­ных мутаций растут только на специально со­ставленной питательной среде, но уже не мо­гут расти вне лаборатории.• Конструирование вектора для трансфор­мации (чаще речь идет о плазмиде для вос­приятия клонированной ДНК) и введениевектора в бактерии, способные к трансфор­мации растительных клеток. Сегодня для транс­формации растений применяется почти ис­ключительно Agrobacterium tumefaciens, возбу­дитель опухолей корончатого галла (см. бокс9.2).

В качестве векторов для трансформациииспользуют производные Ti-плазмиды этойбактерии. Чаще используют плазмиды, кото­рые реплицируются как в Escherichia coli, таки в Agrobacterium tumefaciens, и служат одно­временно как векторы для клонирования и каквекторы для трансформации (рис. С). Опреде­ленная область Ti-плазмиды, область Т-ДНК(Т-ДНК = переносимая — англ. transferierred —ДНК), переносится в растительную клетку истабильно интегрируется в любом месте в ядер­ный геном растения (см. бокс 9.2).E.coliori,s Точка началарепликациидля множествабактерий-хозяевПравая границаТ-ДНКp35S• Трансформация растения-хозяина.

Онапроисходит при использовании Agrobacteriumtumefaciens либо путем кокультивации расти­тельных эксплантов (например, фрагментылистьев табака) с агробактериями, либо пу­тем вакуумной инфильтрации бактерий в се­мена или соответственно меристемы цветка(используется прежде всего для Arabidopsisthaliana, см. бокс 7.1). Проходящие при пере­носе Т-ДНК процессы подробнее рассмотре­ны в боксе 9.2.Для растений, которые нельзя трансфор­мировать с помощью Agrobacterium (например,многие однодольные виды), разработаны дру­гие способы, прежде всего трансфекция (пе­ренос свободных от белков ДНК-молекул вклетку). Так, удается стабильно интегрироватьДНК (например, векторов) путем баллисти­ческой трансфекции («обстрел» растительныхтканей вольфрам-карбидными или золотымичастицами, на поверхность которых нанесенымолекулы ДНК); путем электропорации (крат­ковременное создание импульса высокого на­пряжения между двумя электродами, которыепогружены в раствор растительных протопла­стов и молекул ДНК); химическим путем (на­пример, добавлением полиэтиленгликоля ксмесям протопластов и плазмид); путем мик­роинъекции (ДНК целенаправленно инъеци­руют в определенные клетки).• Отбор успешно трансформированных (илисоответственно трансфицированных) клеток.Это происходит при использовании соответ­ствующих фрагментов генов, которые вводят­ся с помощью Т-ДНК в растительную клетку7.2.

Генетические основы развития [247<Рис. С. Строение вектора для трансформации, пригодного для клонирования в Escherichia coli, идля внедрения в Agrobacterium tumefaciens, который может использоваться для переноса Т-ДНК(см. бокс 9.2) в растения.Вектор несет признаки бактериальных плазмид устойчивости и одновременно содержит все тре­бующиеся для интеграции в ядерный геном элементы Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacteriumtumefaciens (бокс 9.2), однако в одиночку не может вызывать трансформацию растительной клет­ки, так как отсутствуют существенные генные элементы полной Ti-плазмиды (например, v/r-область).

Поэтому чтобы стать способными к трансформации растений, агробактериальные штам­мы должны нести вспомогательную плазмиду (так называемая хэлперная Ti-плазмида без обла­сти Т-ДНК), которая содержит генные элементы, отсутствующие у вектора для трансформации.Показанный для примера вектор несет следующие элементы: точку начала репликации для реп­ликации плазмиды в Escherichia coli (Е. coli oriv) и точку начала репликации для репликации плаз­мид широкого спектра бактерий-хозяев (среди прочих Agrobacterium); ген устойчивости для се­лекции в бактериях-хозяевах (например, npf-ген: он кодирует неомицинфосфотрансферазу ивызывает устойчивость к антибиотикам неомицину и канамицину); правую и левую границы об­ласти Т-ДНК Ti-плазмиды (о структуре и функции этого участка ДНК см.

бокс 9.2). Эти погранич­ные участки, а также все фрагменты ДНК между ними переносятся в ядерный геном растения.Внутри области Т-ДНК находится ген устойчивости для селекции трансформированных расти­тельных клеток (1). Часто используют уже упоминавшийся npf-ген под контролем промотора но­палинсинтазы A. tumefaciens (pnos) с сайтом терминации транскрипции гена нопалинсинтазы(tnos).

Нопалинсинтазный промотор распознается растительной РНК-полимеразой II и содержитцис-элементы, усиливающие транскрипцию (см. 7.2.2.3). Полилинкер (или «сайт множественно­го клонирования» MCS — от англ. multiple cloning site) (2) — это участок ДНК, который несет рас­положенные тесно друг с другом и даже частично перекрывающиеся последовательности узна­вания для множества рестрикционных эндонуклеаз. Полилинкер пригоден для интеграции раз­нообразных рестрикционных фрагментов. В показанном примере в сайт множественного клони­рования вносится целевой ген, который, с одной стороны, фланкирован участком терминаторатранскрипции нопалинсинтазы, а с другой стороны — промотором 35S-MPHK вируса мозаикицветной капусты (p35S; см.

бокс 9.1). Промотор 35S очень сильный и активен почти во всех рас­тительных клетках.В показанном примере последовательность полилинкера находится внутри кодирующей областибактериального гена/acZ', перед которым помещен ген /acl. Это расположение применяется такжево многих других плазмидах для клонирования чужеродной ДНК, так как в этом случае возможноочень простое доказательство успешной вставки ДНК («бело-голубая селекция») в бактериаль­ные хозяйские клетки. В основе метода лежит следующий принцип. Ген 1асТ несет 5'-участок ко­дирующей последовательности фермента В-галактозидазы бактериального гена lacZ. Подходя­щие бактерии-хозяева содержат в хромосомной ДНК З'-участок этого гена, но не полный ген lacZ.В присутствии кодируемого плазмидой гена /acZ' в клетке оба «неполных фермента» в-галакто­зидазы образуются раздельно.

Однако они могут ассоциироваться в функциональную й-галактозидазу, которую можно гистохимически выявить совершенно так же, как В-глюкуронидазу (см.бокс 7.4), с использованием субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-0-галактопиранозида (голу­бое окрашивание бактериальных колоний). Вставленная последовательность полилинкера выб­рана так, что она не нарушает рамку считывания гена 1асТ и не мешает функционированию фер­мента. Однако если из-за вставленного фрагмента ДНК рамка считывания гена/acZ' нарушается,то хозяйские бактерии больше не образуют функциональный N-терминальный неполный фер­мент В-галактозидазы и отсутствующая В-галактозидазная активность проявляется в виде бес­цветных колоний. На чашке Петри с агаром многочисленных колоний можно очень легко отличитьте, которые несут вставку ДНК (белые колонии), от тех, где ее нет (темно-серые колонии).

К томуже ген lacZ (и соответственно В-галактозидазная активность) индуцируется с помощью 1ас\. Этотген кодирует белок-репрессор, который путем связывания с промотор-операторным участкомгена /acZ' препятствует транскрипции гена lacZ до тех пор, пока к клеткам не будет, добавленIPTG — изопропилтиогалактозид. IPTG связывается с белком-репрессором, из-за чего тот покида­ет промотор-операторный участок гена 1асТ и может запускать транскрипцию 1асТ (о структуреи функции /ас-оперона Escherichia coli см.

учебники по молекулярной генетике или микробиологии)248| ГЛАВА 7. ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯи экспрессируются после встраивания в расти­тельный геном (табл. А). Часто применяют геныустойчивости. В примере на рис. С речь идет обактериальном npt-гене, кодирующем неомицинфосфотрансферазу, которая среди прочегоинактивирует путем фосфорилирования ток­сичный для растительных клеток антибиотикканамицин, так что успешно трансформиро­ванные (или соответственно трансфицированные) растительные клетки в присутствии канамицина выживают, в то время как нетрансформ ированные клетки погибают.• Регенерация дифференцированных расте­ний из отобранных клеток.

Если для трансфекции использовали протопласты, то клетки,выжившие в присутствии селективного факто­ра (например: канамицина), могут давать каллусную ткань на подходящей культуральноисреде с ауксином и цитокинином (см. 7.6.2.3).Из этих каллусов путем изменения соотноше­ния ауксин/цитокинин можно регенерироватьполноценные растения в большом количестве(см. рис. 7.47). Для трансформации с использо­ванием Agrobacterium tumefaciens проводят кокультивирование растительных тканей (напри­мер, листовых дисков) с бактериями.

Характеристики

Список файлов книги

Свежие статьи
Популярно сейчас
А знаете ли Вы, что из года в год задания практически не меняются? Математика, преподаваемая в учебных заведениях, никак не менялась минимум 30 лет. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6418
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее