Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 168
Текст из файла (страница 168)
Методы Таблица 8.2. Основные этапы развития рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии и их при- менения к биологическим молекулам Норре-5еу1ег кристаллизует гемоглобин и дает ему название ЯбггЗдеп наблюдает новый вид проникающего излучения при попадании катодных лучей 1электронов) на металлическую мишень. Он называет это излучение Х-лучами 1в русской традиции «рентгеновские лучи») хоп 2ацеполучает первую дифракционную картину при пропускании рентгеновских лучей через кристалл сульфата'цинка »УЛ Вгадд предлагает простое математическое соотношение между дифракционной картиной и расположением атомов в кристалле Вмп»пег выделяет фермент уреазу из экстракта канавални мечевидной и показывает, что белок обладает каталитической активностью РвидпВ публикует свое первое эссе «Природа химической связи», в котором под- робно описывает принципы ковалентного связывания Вета! и Спивуоот представляют первую подробную рентгеновскуюдифракционную каргину белка, полученного из кристаллов фермента пепсина Раззегзоп разрабатывает зналитический метод определения межатомных расстояний из данных рентгеновской кристаллографии АзЗЬцгу получает первую рентгенограмму ДНК В1осй и Рвгсей описывают.
ЯМР РамВпВ и Согеу предлагают структуры спиральной конформации цепи ).-аминокис- лот — а-спирали — и р-листа. Обе структуры впоследствии обнаружены во многих белках 9УвззопиСг)сйнаосноверентгенограммы,полученнойргвпЫ)пи)2дйипз,предлагают модель двойной спирали ДНК Репдз и его коллеги разрабатывают методы тяжелых атомов для решения проблемы фаз в кристаллографии белков КепсЬеш подробно описывает структуру белка 1миоглобина кашалота) с разреше- нием 0,2 нм РепгехпРеДСтавляетструктурубольшего белка темоглобинас меньшим разрешением РЬВВРз описывает структуру лизоцима.
Зто первое подробное описание фермента 2евпег предлагает использовать двумерный ЯМР ))увзйг)сЬ и его коллеги впервые используют метод для расшифровки структуры белка в начале 80-х Квп и К)сЬ и К)мВ и коллеги последнего подробно описывают трехмерную структуру тРНК, полученную при помощи рентгеноструктурного анализа Нойпез и К!иВ расшифровывают структуру вируса табачной мозаики 1ВТМ), а Нвгг)зоп и Возмпап определяют структуру двух маленьких сферических вирусов М)«Ь44, )уе)вепЬоуег и их коллеги при помощи рентгеносгруктурнаго анализа впервые расшифровывают структуру транояембранного белка (бактериального реакционного центра).
Непг)егмзп и его коллеги в 1975-1 990 гг, получают структуру трансмем- бранного белка бактериородопсина методами электронной микроскопии высокого разрешения 1864 1895 1926 1931 1934 1935 1941 1946 1951 1954 1966 1971 1976 1977-1978 1985 Благодаря стремительному увеличенгпо количества последовательностей белков и нуклеиновых кислот в геиомиых базах данных, функция гена — и кодируемого им белка — часто может быть предсказана путем простого сравнения его последова тельиости с уже охарактеризованными (см. рис. 3. 14).
Поскольку амииокислотиая (ЗЗ. Анвпмз белков последовательность определяет структуру белка, а структура определяет биохимическую функцию, белки со сходными аминокислотными последовательностями часто обладают сходной структурой и, следовательно. выполняют одинаковые биохими ческие функции. Это справедливо даже для белков из неродственных организмов. В современной клеточной биологии изучение недавно открытого белка обычно начинается с поиска ранее охарактеризованных белков, обладающих сходными аминокислотными последовательностями. Поиск гомологичных генов или белков среди известных последовательностей обычно производится во всемирной паутине.
Необходимо просто выбрать базу данных и ввести нужную последовательность. Программа совмещения последа вательностей — наиболее популярны В! АВТ и ГАВТА — ищет в базе данных сходную последователыюсть путем перемещения предложенной пользователем последовательности вдоль содержащихся в базе до тех пор, пока не найдет полное Ясоге - 399 Ь1св (1025), Ккресс = е-111 тдепг1гьев 198/290 (68$), Ров1Г1чев = 541/290 (82$), ()аегуг 57 мкввокчккгокотточчтка4иквтвкМчаьккгкьгхвкекочввтагккгвььккьвв 116 ВВ ьякчккхокйтмгзучтка +к т В якьккхкь+ к Вочвктккккхвььки+кв ЯЬЗ'сгг 1 мквткхтГВК1акатуавтгуЮЬВвк((8гВВВ1ЛЬКХткьВВЩ))каутататккгВЬЬККЗГВВ 60 ()иегуг 117 Вктчктд(ачтвтк(всьтьчткв гквтьвсьтд)оьатсвв 176 ВХЧ+Ь ВЧЯК+к Еятьтвкьь ВЬККИЗвь Ьтмктвяо+Ь Ока+Сия ЯЬЗ сс: 61 (ВвтчкьбвзччввВВктзьччктыВВгьккзмвв(В)ВВВВ(ВВФьтквтьтсгьйочатсвв 120 0иегу: 177 ВВЧЬВВВЬКВОКЬЬ1ЗВВВВ)атхьаВРОЬаваРОЧВЧатттВВЧЧтЬМЗКаавтЬЬОВКВ 235 з(кщагквьквсмььх+ к+кгазаввк ввако+ттгкт+~цкчвтьмткаркхььо + яьзсс: 121 вачьвттвьквскььгг46868)зькьаовоьаватохвчвтвтиктгчтьмтвлвкхььоВ)в$180 Яае гу: 2 3 6 твтВчагмвьосп акмчйвввьевоввктаоьвкгвкеьотеькВВмвочтейгвьхквв 2 9 5 твт чр+мв+осхкдтвзч ь* ьвикзвкквььт+хвк ьотв+к мточ+ ьввгк + ЯЬ3 се: 181 татВЧЬЧМВЧОСгтаКМЧ(ВЗК$В ВВОВВВГПКЬВК1ВВВЬОтекк(88МРОЧВВЬРВВКВа 2 4 0 Снегу: 296 векз8860ЬВВВччтвьы($0$$ььвсмьвтаеккктвицбаьеневвопч 345 Квак 0В + ЧУР Ьв О Ьькьмь тье+ККХьа+ КЬ К +Кап+ ЯЬбогг 241 РРКМВВ))аваЖЧЧРВВЗЗВВОВВЬЬВКЗПК(УКРВКвттакватеагвтВКОЬ 290 Рис.
8.30. Результаты поиска с помощью программы В(ДЯТ, В базах данных можно искать сходные аминокислотные или нуклеотидные последовательности. Здесь поиск белков, похожих на человеческий белок-регулятор клеточного цикла Сдс2 (С)иегу — Запрос), возвращает Сдс2 из кукурузы [5ьуст — Обьекгп), который по аминокислотной последовательности на 68 74 идентичен (!делибез — Савпаденоя) человеческому Сдс2, а на 82 Зв на него похож (Раз!пчел — Сходапва).
Совмещение начинается с остатка 57 белка Сгиегу. Это говорит о том, чта у человеческого белка есть Н-концевой участок, отсутствующий у белка кукурузы. Зеленые блоки показывают различия в последовательностях, а желгпые — их совпадение: когда две аминокислотные последовательности идентичны, показывается остаток; консервативные вминокислатные замены обозначают плюсом (+). Введен только один пропуск (бар), он показан красной апрелкай в положении 194 в последовательности Ооегу. Эта сделано для максимального совмещения Итог совмещения (5саге), выражаемый в двух разных единицах измерения, учитывает штрафы за замены и пропуски; чем выше итог совмещения, тем лучше совпадение. Достоверность совпадения отражена в величине ожидания (Ехресг), которая показывает, как часто такое хорошее совмещение может произойти случайно.
Чем меньше значение Ехрест, тем достовернее совпадение; здесь Ехресг очень мало (е ггг), что говорит о гамологичнасти белков. Значения ЕхресЬ превышающие 0 1, показывают что белки скорее всего не родственны. например, ехрест = 0,1 означает, чта такое совпадение случайно в 1 из 10 случаев. 820 Часть 01. Методы или частичное совпадение кластера аминокислотных остатков (рис. 8.30). Результат даже сложного поиска, который может производиться с последовательностью нуклеотидов или аминокислот, возникнет на экране через несколько минут. Такое сравнение может помочь предсказать функцию отдельных белков, белковых семейств или даже большей части белков только что секвенированного организма. В главе 3 показано, что многие белки, имеющие одинаковую конформацию и вьшолняюшие сходные функции, обладают слишком далеким родством, и их нельзя идентифицировать как гомологичные, только сравнивая их аминокислотную последовательность (см.
Рис. 3.13). Таким образом, возможность надежно предсказывать трехмерную структуру белка на основе его аминокислотной последовательности улучшила бы нашу способность выводить функцию белка из информации о последовательностях в геномных базах данных. В последние годы наблюдается значительный прогресс в предсказании точной структуры белка.
Эти предсказания, с одной стороны, основывая>тся на информации о десятках тысяч структур белков, расшифрованных при помощи рензтеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии, а с другой — на вычислениях, берущих начало в наших знаниях о действующих на атомы физических силах. Однако предсказание структуры больших или мультидоменных белков или структур с высоким разрешением для компьютерного дизайна лекарств до сих пор остается сложной и важной задачей.
Нахождение для нового белка гомологичных последовательностей и структур может помочь раскрыть его функцию, но обычно эти предсказания необходимо проверить прямым экспериментом. Полученная совмещением последовательностей информация, однако, часто может указать направление экспериментов, что делает этот метод одним из наиболее важных в современной клеточной биологии. Заключение Большинство белков функционирует совместно с другими белками.
Существует множество методов идентификации и изучения белок-белковых взаимодействий. Малые молекулы-ингибиторы позволяют исследовать функции белков, на которые они действуют, в живой клетке. Поскольку белки со сходной структурой часто выполняют сходные функции, биохимическую активность белка можно предсказать путем поиска в базах данных ранее охарактеризованных белков со сходной аминокислотной последовательностью. 8.4. Анализ и манипуляции с ДНК Вплоть до 70-х гг.
ДНК оставалась наиболее сложной для биохимического анализа молекулой. Очень длинная и химически однородная последовательность нуклеотидов, формирующая генетический материал организма, могла быть исследована только косвенно путем секвенирования белков или РНК или с помощью генетического анализа. В настоящее время ситуация полностью изменилась. ДНК перестала быть наиболее сложной для анализа макромолекулой в клетке, наоборот, теперь ее анализировать проще всего.
Можно изолировать конкретный участок практически любого генома, получить неограниченное количество его копий и расшифровать его нуклеотидную последовательность всего за несколько часов. На пике проекта «Геном человека» крупные лаборатории круглые сутки со скоростью 1000 нуклеотидов в минуту синтезировали последовательности ДНК на авпн матическом оборудовании. Родственные методы позволяют произвольно изменять 6,4.АнализиманипуляциисДНК 821 (конструировать) изолированные гены и переносить их обратно в зародышевые линии животных или растений, где они становятся функционирующей и наследуемой частью генома организма.
Эти технические прорывы в генной инженерии -- науке, занимающейся высокоточными методами рабах>ты с ДНК в пробирке или организме, — повлияли на все аспекты кзеточной биологии, невероятно ускорив изучение клеток и их макромолекул. Методы рекомбинантиых ДНК обьединяют несколько методик, часть из которых разработана совсем недавно, а часть позаимствована из других областей, например, генетики микробов (таблица 8.3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
