Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 165

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 165)

Двумерный электрофорез в поливкрилвмидном геле. В этом геле разделены все белки бактериальной клетки Е. соа Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли методом изоэлектрического фокусирования в соответствии с их изоэлектрическими точками в направлении слева направо. Дальнейшее фракционирование проводили в соответствии с их молекулярной массой при помощи электрофореза сверху вниз в присутствии ДСН. Заметим, что различные белки присутствовали в различных количествах. бактерии выращивали в культуре, содержащей меченные радиоизотопзми аминокислоты, поэтому все белки были радиоэктивны, и их можно было обнаружить при помощи радиоавгогрэфии (см.

стр. 602-б03). 1С любезного разрешения Ратно)г О'гэгге!Ц идеально изолировать органеллу, и некоторые из обнаруженных белков будут «загряз няюгцими». Их часто можно исключить путем анализа соседних фракций, полученных при очищении органелл, н «вычитания» их из максимума фракции органеллы. 8.3.5. )взДроДмнамзлчеснме мвмеренмл ловволвзот установвтть размер и форму белковых комплексов Большинство белков в клетке функционирук>т в составе комплексов, и знания о размере и форме этих комплексов часто указывает на их функцию. Существует несколько важных способов получения такой информации.

Комплекс иногда можно напрямую визуализировать при помощи электронной микроскопии, как описано в главе 9. Дополнительно к этому существует подход, основанный на пздродина мических свойствах комплексов, то есть на их поведении при движении в жидкой среде. Обычно проводят два независимых измерения.

Сначала измеряют скорость осаждения комплекса в поле центробежных сил, созданном ультрацентрифугой (см. рис. 8.11, а). Полученная в результате константа седиментации (или величина 8) зависит как от размера, так и от формы комплекса и сама по себе не дает полезной информации. Однако после проведения второго гидродинамического измерения-- построения графика движения комплекса через колонку для гель хроматографии (см. рис, 8.13, 6) — можно рассчитать приблизительную форму комплекса и его молекулярную массу.

100— 8 Ф а Е бо — ез о в х ст ст о 2б —- в а .т„еа ъ„д«~ .:.,-:.;.': к ф„::,уф::=:;.:"::»«фхх 8.3. Анализ белков 807 Молекулярную массу также можно оценить проще при помощи аналитической центрифуги, сложного прибора, позволяющего производить измерения поглощения белка, когда образец подвергается действию центробежных сил. При этом подходе образец центрифугируют до тех пор, пока он не достигнет состояния равновесия, при котором действующая на белковый комплекс центробежная сила точно уравновесит диффузию комплекса.

Точка равновесия зависит от молекулярной массы комплекса, но не от его формы, поэтому метод позволяет напрямую рассчитать молекулярную массу для определения стехиометрии каждого белка в белковом комплексе. 8.3.6. Группы взаимодействующих белков можно идентифицировать при помощи биохимических методов Поскольку большинство белков в клетке функционируют в составе комплексов с другими белками, для характеристики биологической роли неизвестного белка важно сначала идентифицировать все белки, с которыми он специфически связывается. Коизьчунопреципитация является одним из методов идентификации прочно связывающихся друг с другом белков. В данном случае антнтело узнает специфический белок-мишень; затем связанные с антителом и прикрепленные к твердой матрице химические соединения вытягивают комплекс из раствора и на дно пробирки.

Если во время образования комплекса с антителом исходный белок-мишень достаточно прочно связан с другим белком, то его партнер также будет преципитирован. Этот метод полезен для идентификации входящих в комплексы внутри клетки белков, включая тех, которые взаимодействуют с другими молекулами только временно, например, когда внеклеточные сигнальные молекулы стимулируют клетку (см, обсуждение в главе 15).

Другим часто используемым методом идентификации белков-партнеров является аффинная хроматография (см. рис. 8.13, в). Модификация этого метода для обнаружения взаимодействующих белков состоит в том, что интересуюший белок прикрепляется к полимерным гранулам колонки. Когда белки в клеточном экстракте промываются при прохождении через колонку, те белки, которые взаимодействуют с интересуюшим белком, задерживаются аффинной матрицей. Затем их можно элюировать и идентифицировать с помощью масс-сиектрометрии. В дополнение к фиксации белковых комплексов на колонках или в пробирках для изучения белковых взаимодействий исследователи разрабатывают высокоплотные белковые чипы.

Эти биочипы, содержащие тысячи различных белков или антител, нанесенных на стеклянную подложку или иммобилизованных в очень маленьких лунках, позволяют исследовать биохимическую активность и профили связывания одновременно большого количества белков. Например, если инкубировать флуоресцентно меченый белок с биочипами, содержащими тысячи иммобилизованных белков, пятна, которые сохранят способность к флуоресценции после отмывания, будут содержать белок, с которым исходный белок специфически связывается. 8.3.7.

Белок-белковые взаимодействия также можно идентифицировать методом дрожжевой двугибридной системы До настоящего момента мы делали упор на биохимические подходы к изучению белок-белковых взаимодействий. Однако один из наиболее эффективных методов — двугибридные системы — основан на применении внутренних клеточных механизмов для обнаружения белок-белковых взаимодействий.

8.3. Анализ белков 809 модействия происходят в ядре дрожжевой клетки, так можно исследовать белки из любой части клетки и любого организма. Созданы двойные гибридные системы, позволяющие создать схему взаимодействий между всеми белками, сиитезирующимися в организме. В данном случае для каждого белка конструируются химерные белки «иаживки» и «добычи», что позволяет наблюдать любую комбинацию этих белков. При помощи этого метода созданы карты взаимодействий большинства белков дрожжей, круглого червя С. е!едапт и мушки дрозофилы. 8.3.8.

Объединение полученных разными методами данных дает надежные карты белковых взаимодействий Как показано в главе 3, подробные карты белковых взаимодействий могут быть очень полезны для определения функций белков (см. рис. 3.82). Поэтому метод двойных гибридов и описанный выше биохимический метод, известный как таидемиая аффиииая очистка (см. разд, 8.2.5), были автоматизироваиы для определения тысяч взаимодействующих белков. К сожалению, различные эксперименты приводят к разным результатам, и многие обнаруженные в одной лаборатории взаимодействия пе обнаруживают в другой.

Таким образом, наиболее надежные карты белковых взаимодействий включают в себя данные многих экспериментов, то есть каждое отмеченное иа карте взаимодействие подтверждено более чем одним методом. 8.3.9. Оптические методы позволяют наблюдать белковые взаимодействия в реальном времени Как только стало известно, что два белка (или белок и малая молекула) связываются, возникла необходимость более подробно охарактеризовать их взаимодействие. Белки могут связываться друг с другом иа более-менее продолжительное время (иапример, как субъедииицы РНК-полимеразы или протеосомы) или всего иа несколько миллисекунд (как кииаза и ее субстрат).

Для понимания механизма функционирования белка в клетке необходимо определить, насколько крепко ои связывается с другими белками, как быстро ои от иих диссоциирует, и как ковалеитиые модификации, малые молекулы или другие белки влияют иа эти взаимодействия. Такого рода исследования динамики белков часто требуют использования оптических методов. Определенные аминокислоты (иапример, триптофап) обладают слабой флуоресценцией, которую можно обнаружить при помощи чувствительных флуориметров. Часто интенсивность флуоресцеиции, или спектр испускания, флуоресцирующих аминокислот, расположенных в области контакта двух белков, изменяется при связывании этих белков.

Когда такое изменение может быть зафиксировано при помощи флуориметрии, становится возможным получить точное количественное описание процесса связывания белков. Особенно полезным методом исследования динамики связывания белков с другими молекулами является поверхностный плазмоииый резонанс (ЯРК). Этот метод позволяет охарактеризовать широкий спектр молекулярных взаимодействий, включая связывание аитигеиа с аитителом, лигаида с рецептором, белков с ДНК, углеводами, малыми молекулами и другими белками. ЯРК регистрирует связывание молекул путем слежения за отражением луча света от границы раздела между водным раствором потенциально связывающих- 810 Часть((1, Методы призма, или а) падающий днфракционная Решетка отраженный свет е~ф золотая пленка С (-50 нм) ~ индуцированное плазмонами очень маленькое электрическое попе распространяется мопекупа-«наживка» эа пределы золотой пленки б) Связывание молекул «добычи» с молекулами «приманки» повышает показатель преломления поверхностного слоя, что влияет на резонансный угол воэбу1кдения ппазмонов, изменения которого мшкно измерить детектором диссоциация з з з о мин добавление пРомывка молекул буфером «добычи» Рис.8.25.

Поверхностный плазмонный резонанс. а) Метод обнаруживает взаимодействия, контролируя отражение луча света от границы раздела между водным раствором потенциально связывающихся молекул (показаны зеленым) и поверхностью биодамика, на которую нанесен иммобилизованный белок-«наживка» (показан красным), б) Раствору белков-«добычи» разрешено обтекание иммобилизованного белка-«наживки». Связывание молекул-«добычи» с белками-«наживкой», а также распад комплекса при их отмывании буферным раствором, приводит к регистрируемому изменению резонансного угла.

Характеристики

Список файлов книги