Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 160
Текст из файла (страница 160)
Нормальные фибробласты человека, например, в культуре обычно делятся только 25 — 40 раз. В таких клетках ограниченная способность к пролиферации отражает постепенное укорочение теломер — расположенных на концах хромосом последовательностей ДНК с большим количеством повторов и специальными белками (см, главу 5). Соматические клетки человека отключили синтез фермента теломеразы, за счет которой поддерживается постоянная длина теломер, и поэтому теломеры укорачиваются с каждым делением. Человеческие фибробласты можно уговорить пролифелировать бесконечно, введя в них ген, кодирующий каталитическую субъединицу теломеразы; в этом случае их можно размножать в качестве «бессмертной» клеточной линии.
Однако некоторые клетки человека нельзя обессмертить таким способом. Несмотря на то что их теломеры остаются длинными, они все равно прекрагцают делиться после ограниченно~о числа делений, так как условия культивирования в конце концов запускают механизм контрольных точек клеточного цикла (см. главу 17), который останавливает клеточный цикл, — этот процесс иногда называют культуральным шоком.
Чтобы эти клетки не прекращали делиться, недостаточно одного введения теломеразы. Необходимо также инактивировать механизм контрольных точек. Это можно сделать путем введения определенных стимулируюших рак онкогенов, выделенных, например, из опухолеродных вирусов (см. главу 20). В отличие от клеток человека, большинство крысиных клеток не отключает синтез теломеразы, и их теломеры не укорачиваются с каждым делением. Таким образом, если удалось избежать культурального шока, некоторые типы клеток крыс будут бесконечно делиться в культуре. Более того, в клетках грызунов часто происходят генетические изменения, инактивируюшие механизм контрольных точек, что приводит к спонтанному возникновению бессмертных клеточных линий.
Клеточные линии проще всего получить из раковых клеток, но такие культуры, называемые трансформированными клеточными линиями, будут отличаться от культур, приготовленных из нормальных клеток. Например, трансформированные клеточные линии часто растут без прикрепления к поверхности, и они способны пролифелировать в культуральной чашке при значительно большей плотности клеток. Экспериментально можно привить сходные свойства и нормальным клеткам путем трансформации опухолеродным вирусом или химическим соединением. Полученные таким образом клеточные линии после введения в восприимчивое животное способны вызвать рост опухолей (хотя обычно на это способна только небольшая субпопуляция, а именно раковые стволовые клетки — см, главу 20).
Как трансформированные, так и нетрансформированные клеточные линии очень полезны для исследования клеток в качестве источников большого числа однородных по типу и свойствам клеток. Более того, их можно хранить в жидком азоте при — 1Вб 'С практически неограниченное время, и после разморозки они сохраняют свою жизнеспособность. Однако важно помнить, что клетки в обоих типах клеточных линий почти всегда принципиально отличаются от своих прародителей в тканях, из которых они были выделены. Некоторые из широко используемых клеточных линий перечислены в таблице 8.1.
Разные линии обладают разными достоинствами; например, эпителиальные клетки линии Р(К, полученные из кенгуровой крысы, в отличие от клеток многих других линий, которые округляются во время митоза, всегда остаются плоскими, что позволяет легко наблюдать митотический аппарат в действии. 78ч Часть Ш. Методы 8.1.5. Трансплантация ядер соматических клеток способна привести к созданию персональных стволовых клеток Термин «клонирование» используют в качестве короткого обозначения нескольких довольно различных типов процедур. Необходимо понимать эти различия, особенно в связи с общественной дискуссией об этике исследования стволовых клеток. В биологии клон — это всего лишь набор генетически идентичных друг другу особей, произошедших из одного предшественника.
Самым простым типом клонирования является клонирование клеток. Таким образом, можно выделить из кожи одну эпидермальную стволовую клетку, позволить ей расти и делиться в культуре и в результате получить большой клон генетически идентичных эпидермальных клеток.
Их можно затем использовать, например, для восстановления кожного покрова пациентов с тяжелыми ожогами. Такого рода клонирование является не чем иным, как искусственным усилением процессов клеточной пролиферации и заживления, происходящих в человеческом теле в нормальных условиях. Клонирование целых многоклеточных организмов — репродуктивное клонироеание — это совершенно другой процесс. Здесь задействованы механизмы, радикально отличающиеся от естественных природных процессов. Обычно у каждо~о животного есть мать и отец, и оно генетически отличается от них.
При репродуктивном клонировании отпадает необходимость наличия двух родителей и сексуального союза для зарождения жизни. В случае млекопитающих выдающиеся результаты достигнуты на овцах и некоторых других домашних животных при помощи трансплантации ядер соматических клеток. Процедура начинается с неоплодотворенной яйцеклетки. Из этой гаплоидной клетки высасывают ядро и заменяют его ядром обычной диплоидной соматической клетки.
Диплоидную донорскую клетку обычно извлекают из ткани взрослой особи. Гибридная клетка, состоящая из диплоидного донорского ядра и цитоплазмы яйцеклетки реципиента, некоторое время развивается в культуре. В небольшом количестве случаев происходит формирование эмбриона, который затем помешают в матку суррогатной матери (рис. 8.6). Если экспериментатору повезет, развитие зародыша пойдет нормально и в конце концов родится новое животное. Полученная таким образом, при помощи репродуктивного клонирования, особь будет генетически идентична взрослой особи, служившей донором диплоидной клетки (за исключением небольшого количества заключенной в митохондриях генетической информации, которая наследуется исключительно из цитоплазмы яйцеклетки).
Терапевтическое клонирование значительно отличается от репродуктивного. В этом случае метод трансплантации ядер соматических клеток применяют для создания персональных ЭС клеток (см. рис. 8.6). Здесь эмбрион на очень ранней стадии развития, состоящий из примерно 200 клеток, не переносится в матку суррогатной матери. Вместо этого его хранят в культуре и используют в качестве источника ЭС клеток с целью их дифференцировки в различные типы клеток, которые можно будет применять для восстановления тканей. Полученные таким путем клетки генетически практически идентичны донору исходного ядра, поэтому их можно трансплантировать обратно в донора без риска иммунологической реакции.
Трансплантация ядер соматических клеток потенциально имеет еще одно достоинство — она может позволить изучать наследственные заболевания человека. ЭС клетки, получившие соматическое ядро от особи с наследственным заболеванием, могут позволить напрямую исследовать развитие заболевания по мере диф- 8,1. Выделение и выращивание кпетпн В куЛЬтУре . 785 РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ неоплодотворенная удаление ядра яицеклетка иэ яицеклетки зрелой самки ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ Рис. В.б. Репродуктивное и терапевтическое клонирование. Клетки взрослого организма можно ис- пользовать для репродуктивного клонирования или создания персональных ЭС клеток (так называемого терапевтического клонироеанияй ференцировки их в различные типы клеток. «Болезнеспецифические» ЭС клетки и их дифференцированных потомков также можно использовать для разработки и тестирования новых лекарств.
Эти подходы до сих пор находятся на начальных этапах, и во многих странах определенные аспекты исследоваггий запретцены за коном. Остается неясным, возможно ли создавать человеческие ЭС клетки при по мощи трансплантации ядер, и способны ли они в полной мере оправдать надежды, возлагаемые на них учеными. Антитела — очень полезный инструмент клеточной биологии. Их высокая специфичность позволяет визуализировать расположение нескольких конкретных белков из многих тысяч, синтезируемых клеткой. Антитела часто получают путем прививки животным интересующего белка и последующего выделения из сыворотки крови специфичных к этому белку антител. Однако в результате получается неоднородная смесь антител, распознающих разные антигенные сайты макромолекулы.
Более того, одно привитое животное может дать ограниченное число антител, а у разных особей антитела будут отличаться. К тому же специфичные к нужному антигену антитела составляют лишь некоторую часть всех антител в сыворотке крови. Альтернативным подходом, позволяющим получить неограниченное число идентичных друг другу антител и значительно увеличить специфичность и применимость основанных на антителах методов, является синтез антител клеточными линиями гибридомы. Эта технология, разработанная в 1975 г., совершила переворот в синтезе антител как для нужд клеточной биологии, так и д~и диагностики и лечения некоторых за болеваний, например, ревматического артрита и рака.
Процедура основана на методе получения клеточных гибридов (рис. Х.7) и включает в себя выращивание клеточ ФФ ф18 аа клетки зрелой кланнруемый генам веретено уя КЛЕТОК ИЛИ КЛЕТОЧНОЕ развития теленок эмбрион переносят в матку сурромтной матери клетки зародыша на ранней стадии развития переносят в культурвльную чаюку ЗС клетки гбб ЧаСтЬ'!й. МЕТОДЫ три ююнв гибридиьж клеток СУСПЕНЗИЮ ДВУХ ТИПОВ КЛЕТОК ЦЕНТРИФУГИРУЮТ С ДОБАВЛЕНИЕМ АГЕНТА, СПОСОБСТВУЮЩЕГО ИХ СЛИЯНИЮ СЛИЯНИЕ КЛЕТОК И ОБРАЗОВАНИЕ ГЕТЕРОКАРИОНОВ ПОДДЕРЖИВАЕМЫХ ЗАТЕМ ::; гш~;.рхсг.;~ )ф ф, г!!~ В СЕЛЕКТИВНОЙ СРЕДЕ ВЫЖИВАЮТ И ПРОЛИФЕЛИРУЮТ ТОЛЬКО ГЕТЕРОКАРИОНЫ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
