Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 162
Текст из файла (страница 162)
62. Очисп(а бепков 791 МЕТОД б) СЕДИМЕНТАЦИОННОГО РАВНОВЕСИИ СКОРОСТНАЯ а) СЕДИМЕНТАЦИЙ образец % " ' - большой градиент плотности сахаровы (например, 20 — 70 %) образец стабилизирующий слабый градиент концентрации сахаровы (например, 5-20 %) ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ медленно осаждающийсл компонент быстро осаждающийсл компонент ! ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ компонент с низкой плавучей плотностью — компонент с высокой плавучей плотностью Рис.
8 11. Сравнение методов скоростной седиментации и седиментацтюнного равновесия. а) При скоростной седиментации субклеточные компоненты, нанесенные на содержащий сахарову разбавленный раствор, осаждаются с разной скоростью в зависимости от размера и формы. Чтобы избежать конвекционного смешивания различных полос, вызываемого небольшими различиями в температуре или концентрации раствора, в пробирке создают непрерывный слабый градиент сахаровы, концентрацил которой возрастает в направлении дна пробирки [обычно от 5 до 20% сахаровы).
После центрифугированил разные компоненты можно выделить по одному путем прокалыванил дна пластиковой центрифужной пробирки и сбора капель, как показано на рисунке. б) В методе седиментационного равновесия субклеточные компоненты движутся вверх или вниз при центрифугировании в градиенте до тех пор, пока они не достигнут положения, в котором их плотность будет совпадать с плотностью окружающего раствора.
Несмотря на то что здесь показан градиент сахаровы, длл разделения белков или нуклеиновых кислот удобнее использовать более плотные градиенты, которые можно создавать при помощи хлорида цезия. Получившиеся в равновесии полосы можно собрать так же, как показано на рис.
8.11, а. выделить по одной. Относительная скорость седиментации каждого компонента зависит, в первую очередь, от его размера и формы, обычно описываемых в терминах коэффициента седиментации, или величины Я. Современные центрифуги вращаются со скоростью до 80000 оборотов в минуту, а центробежная сила в них может в 500000 раз превышать силу гравитации. Эти огромные силы заставляют 792 Часть Ш. Методы даже маленькие макромолекулы, например молекулы тРНК и простые ферменты, седиментировать с ощутимой скоростью, и, таким образом, их можно отделить друг от друга по размеру. Ультрацентрифуги также используют для разделения клеточных компонентов в зависимости от их плавучей плотности, вне зависимости от размера и формы.
В этом случае образец седиментируют через большой градиент плотности, содержаший высокие концентрации сахарозы или хлорида цезия. Каждый клеточный компонент начинает движение против градиента (см. рис. 8.11, а), но в конце концов он достигнет положения, в котором плотность раствора будет равна его собственной плотности. После этого компонент будет плавать на поверхности и не сможет двигаться дальше. Таким образом, в центрифужной пробирке образуется набор отдельных полос, из которых наиболее близкие ко дну будут обладать наибольшей плавучей плотностью (рис. 8.11, 6). Так называемый метод седиментационного равновесия настолько чувствителен, что позволяет отделять макромолекулы, содержащие тяжелые изотопы, например гзС или о)ч, от таких же макромолекул, содержаших более легкие, распространенные изотопы ('1С или ")Ч). На самом деле метод с использованием градиента хлорида цезия разработали в 1957 г.
для разделения меченой и немеченой ДНК после добавления в среду к растушим популяциям бактерий предшественников нуклеотидов, содержащих 'э1Ч; этот классический эксперимент предоставил прямые доказательства полуконсервативной репликации ДНК (см, рис. 5.5). 8.2.2. Клеточные экстракты представляют собой доступные системы для изучения клеточных функций Изучение выделенных в центрифуге органелл и других крупных субклеточных компонентов внесло неоценимый вклад в наше понимание функций различных клеточных компонентов. Эксперименты на очищенных при помощи центрифугирования митохондриях и хлоропластах, например, оказали центральную функцию этих органелл — преобразование энергии в формы, доступные для использования клетками.
Точно так же замкнутые везикулы, образовавшиеся из фрагментов шероховатого и гладкого эндоплазматического ретикулума (микросомы), были отделены друг от друга и проанализированы в качестве моделей этих компартментов в интактной клетке. Концентрированные клеточные экстракты, в частности экстракты ооцитов Хепориз 1иеои (африканской шпорцевой лягушки), сыграли главную роль в изучении таких сложных и высокоорганизованных процессов, как цикл клеточного деления, расхождение хромосом при помоши веретена деления и везикулярный транспорт при движении белков из эндоплазматического ретикулума через аппарат Гольджи в плазматическую мембрану. По сути, клеточные экстракты представляют собой исходный материал для полного разделения всех отдельных макромолекулярных компонентов клетки.
Теперь мы рассмотрим, как достигается такое разделение, сосредоточив свое внимание на белках. 8.2.3. Белки можно разделить при помощи хроматографии Чаше всего белки разделяют при помоши колоночной хроматографии, при этом смесь растворенных белков пропускают через колонку, содержащую твердую пори- 82.
Очистка белков 793 етую матрицу (сорбент). Различные белки по разному взаимодействуют с сорбе» том и задерживаются на матрице, их можно будет собрать отдельно по мере выхода из колонки (рис. 8. >2). В зависимости от выбора матрицы белки можно разделить по заряду (ионообменная ), гидрофобности (гидрофобная), способности связывать определенный вид малых молекул или макромолекул (аффинная хроматография) и размеру (гель хроматография или гель фиг>ьтрация). КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ нанесение нв верх колонки постоянно наносят образца в большом количестве рвстворитель твердая матриц 0ПЙЙ пористая пробка зпюироввнные и собранные разделенные молекулы время Рис. ВД2. Разделение молекул методом колоночной хромзтотрвфии.
Образец — раствор, содержащий смесь различных молекул, — нзносят нз цилиндрическую стеклянную или пластиковую колонку, содержащую проницземую твердую матрицу, например целлюлозу. Затем через колонку медленно прокзчивзют большой объем растворителя и собирают его в разные пробирки по мере выхода. Поскольку различные компоненты движутся по колонке с разными скоростями, они будут разделены по разным пробиркам.
Многие виды сорбентов доступны коммерчески (рпс. 8.>3). Ионсюбме>зные колонки заполнены маленькими гранулами, несу>цими либ>о положительный, либо отрицательный заряд, позтому белки разделяются на них в зависимости от распределения зарядов на поверхности. Гидрофобные колонки заполнены гранулами, из которых выходят гидрофобные боковые цепи, селективно удерживающие расгк>ложенные на поверхности белков гидрофобные области. Колонки для гель фильтрации, в которых происходит разделение белков в зависимости от размера, содержат мельчайшие пористые гранулы: молекулы, которые достаточно малы для того, чтобы проникать в поры, долыпе задерживаются в колонке, тогда как крупные молекулы остаются в растворе, омывающем сорбент, и, таким образом, движутся быстрее и первыми выходят из колонки.
Помимо разделения молекул, гель-фильтрация служит удобным способом определения их размера. Неоднородности сорбентов (например, целлюлоза), приводящие к неравномерному потоку растворителя через колонку, ограничивают разрешение обычных методов колоночной хроматографии.
Специальные смолы для хроматографии Чвсть))). ВбвтоДы поток растворителя поток растворителя ( Ф- еф Е-$ Ф- и+ + Ф Ф+ +++ + ++Ф + а е+ + + Ф- + Ф + + + + ++я- и- ° ° + Ф+ е ° + +е~в"— Ф+,г. + + ° -+ ++и-+ Ф+ е + ° Ф~ + гра пупа, заряженная положительно пористые гранулы связанные молекулы, эарвкенные отрицательно свободные молекулы, заряженные положительно мелкие молекулы задерживаются крупные молекулы Ф не задерживаются в) ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ б) ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ поток растворителя Рис.
8.13. Три типа используемых в хроматографии сорбентоа. а) В ионообменной хроматографии нерастворимый сорбент несет ионные заряды, задержи- ф Ф(~~ ф гранупа кь э вающие движение несущих противоположный заряд с ковалентно молекул В качестве сорбентов для разделения белков Ъ чв ~ = связанным Т))з Ч(Р субстратом используют положительно заряженнуюдиэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЗАЭ-целлюлозу) и отрицательно за- ачьФ ф связанная ряженные карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу) и фосфоцеллюлозу.
Также часто используют аналоги, бр ф основанные на агарозе или других полимерах. Сила 'ч ф у,г Ф- АРУгие ки связывания растворенных молекул с ионообменнай ~ йрохадят, ~ А не задерживаясь матрицей зависит от ионной силы и РН проходящего че/ ) рез колонку раствора. Таким образом, для достижения эффективного разделения их можно систематически изменять (как на рис.
814). б) При гель-фильтрации сорбент инертен, но содержит поры. Молекулы, которые достаточно малы для того, чтобы прон икать в поры, задерживаются в них и, таким образом, движутся по колонке медленнее, чем крупные молекулы, не способные входить в поры сорбента. Доступен широкий ассортимент гранул поперечно сшитых полисахаридов (декстрана, агарозы или акриламида) с разными размерами пор, что позволяет использовать их для разделения молекул различной молекулярной мас- сы — от менее чем 500 Да до более чем 5 х 10з Да, в) В аффи иной хроматографии применяется нераство- римый сорбент, ковалентна связанный со специфическим лигандом, например молекулой антитела или субстратом фермента, которые будут связывать определенный белок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
