Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 166
Текст из файла (страница 166)
Эти изменения, наблюдаемые в реальном времени, отражают образование и распад молекулярных комплексов. присоединена к золотой пленке при помощи гибкой связки ., ' Ф 4 (з', . Э е ' '. Раствор мвлвкул.«добычи» РаствоР . »з) .:, ~: ',', буферный ~„г ' ф, «добычи» залатан пленка свет од определенным зонансным углом возбуждает верхнастные ила»маны 8.3.Аиализбелков 811 ся молекул и поверхностью биодатчика, несущего иммобилизоваииый белок«иаживку». Интересующий белок прикреплен к очень тонкому слою металла, иаиесеппого иа одну сторону стеклянной призмы (рис.
8.25). Луч света пропускают через призму; под определенным углом, называемым резонансным, энергия света взаимолействует с электронным облаком металлической пленки, что приводит к возникновению плазмоиа — колебания электронов перпендикулярно плоскости пленки. Электроны «прыгают» вверх и вниз между верхней и нижней поверхиостями пленки, как груз иа пружинке. Плазмои, в свою очередь, сверху и снизу металлической поверхиости создает электрическое поле, распространяющееся иа очень короткое расстояние — порядка длины волны света. Любое изменение состава среды в пределах электрического поля приведет к измеряемому изменению резонансного угла. Для исследования связывания раствор белков (или других молекул), которые потенциально взаимодействуют с иммобилизоваииым белком-«иаживкой», пропускают мимо поверхности биодатчика.
Белки, связывающиеся с наживкой, изменяют состав молекулярных комплексов на металлической поверхности, что приводит к изменеиию резонансного угла (см. рис. 8.25). Изменение резонансного угла происходит в реальном времени и отражает кинетику связывания/диссоциации молекул с интересующим белком. Константу связывания л»„измеряют по мере взаимодействия молекул, а константу распада комплексов Й»п определяют по мере того, как буфер отмывает связанные молекулы с поверхности датчика. Константа равновесия рассчитывается путем деления л»п иа (г»„. Помимо измерения кинетики, ЯРК можно использовать для определения числа молекул в комплексе: иитеисивность сигнала изменяется пропорционально массе иммобилизоваииого комплекса.
Метод ЯРК особенно эффективен, поскольку ои требует малых количеств белка, иет необходимости метить белок и взаимодействие белка с другими молекулами можно наблюдать в реальном времени. В третьем оптическом методе исследования белковых взаимодействий используется зеленый флуоресцентный белок ОГР (см, ниже) и его производные различной окраски.
В этом подходе два интересующих белка метят различными флуорохромами таким образом, чтобы спектр испускания одного флуорохрома перекрывался со спектром поглощения другого. Если два белка и прикрепленные к иим метки сближаются на очень короткое расстояние (в пределах 1 — 10 нм), то энергия поглощенного света передается от одного флуорохрома другому. Передачу энергии, иосяшую название резонансного переноса энергии флуоресцеиции (Е1погезсепсе Кезопапсе Епегйу Тгапз(ег, РКЕТ), регистрируют путем освещения первого флуорохрома и измерения испускания второго (рис. 8.26).
Этот метод особенно эффективен в сочетании с флуоресцентной микроскопией, поскольку ои позволяет характеризовать белок-белковые взаимодействия в определенных областях живой клетки. 8.3.10. Некоторые методы позволяют следить за отдельными молекулами Вышеописанные биохимические методы применяют для изучения больших популяций молекул.
Это ограничение отражает малые размеры биологических молекул по отношению к чувствительности методов их обнаружения. Однако последние разработки высокочувствительпых и точных измерительных методов Чв ъ!1).й)(втоды синий флуоресцентный зеленый флуоресцентный белок испускания белок излучение фиолетовым 4(фф УВУ' света светом ...', ' " света светам белок Х белок У а) зепеныи фиолетовый свет дфа$,,::""'::~;~!.!':г на выходе на входе гвВВ фиолетовый на входе4((~фэ на выходе б) БЕЛКИ НЕ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮТ ЗЕЛЕНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК НЕ ВОЗБУЖДАЕТСЯ, РЕГИСТРИРУЕТСЯ СИНИЙ СВЕТ в) ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ РЕЗОНАНСНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ,РЕГИСТРИРУЕТСЯ ЗЕЛЕНЫЙ СВЕТ Рис.
В.26. Резонансный перенос энергии флуоресценции (РВЕТ). Чтобы определить взаимодействие двух белков в живой клетке, их сначала синтезируют в виде химер совместно с зеленым флуоресцентным белком (БРР) или его производными другого света, а) В данном примере белок Х сшит с голубым флуоресцентным белком (таВСРР), который возбуждается фиолетовым светом (370-440 нм) и испускает синий свет (440-480нм); белок У сшит с зеленым флуоресцентным белком, который возбуждается синим светом и испускает зеленый (5 10 нм). 6) Если белки Х и У не взаимодействуют при освещении образца фиолетовым светом будет наблюдаться флуорес цен ция только голубого флуоресцентного белка. в) При взаимодействии белков Х и У может произойти резонансный перенос энергии флуоресценции. Освещение образца фиолетовым светом возбуждает синий флуоресцентный белок, его испускание, в свою очередь, возбуждает зеленый флуоресцентный белок, что приводит к испусканию зеленого света.
Флуорохромы должны быть близко расположены (на расстоянии около 1-10 нм), чтобы произошел перенос энергии. Поскольку не все молекулы белков Х и У связаны постоянно, можно наблюдать некое юлубое свечение. Но как только белки начинают взаимодействовать, испускание донора БРР падает, а испускание акцептора 6РР растет. привели к возникновению новой ветви биофизики — исследованию одиночных молекул. Изучение отдельных молекул особенно важно для клеточной биологии, потому что в основе многих процессов лежит функционирование нескольких критических молекул в клетке.
Первый пример исследования функции одиночной м<>лекулы белка — использование контактного прижимного элект)юда для измерения прохождения электрическо го тока через единственный ионный канал (см. рис. 11.33). Другой подход состоит в прикреплении белка к более крупной структуре, например грануле полистирола, которую затем можно наблюдать при помощи обычной микроскопии. Этот подход дал особенно полезные результаты при измерении движения моторных белков.
К грануле, например, можно прикрепить молекулы двигательного белка кинезина (см. главу 1б). В результате, наблюдая движение связанной с кинезином гранулы вдоль микротрубочки, можно измерить величину шага мотора (то есть расстояние, пройденное за счет гидролиза одной молекулы АТР). Как мы увидим в главе 9, 8.3. Анализ белков 813 оптические микроскопы обладают ограниченным разрешением за счет дифракции света, но для определения положения гранулы с гораздо Сюльшей точностью, чем позволяет разрешение микроскопа, можно сочетать вычислительные и оптические методы.
При помощи такого подхода можно легко обнаруживать и количественно описывать очень малые движения — порядка нанометров. Еще одно достоинство прикрепления молекул к более крупным гранулам — эти гранулы могут служить «рычагами», с помощью которых становится возможным манипулировать молекулами. Это позволяет прилагать к молекулам силы и наблюдать их ответ. Например, скорость или величину шага мотора можно измерить как функцию силы, против которой он работает. В следующей главе описано как можно использовать сфокусированный лазерный луч в качестве «оптического пинцета» для приложения к грануле механической силы и исследования белков под действием внешних сил (см. рис.
9.35). На гранулы также можно воздействовать магнитными силами; этот метод носит название «магнитного пинцета». Если в магнитном поле находится множество гранул, на них всех будет действовать одинаковая сила, что позволяет параллельно, в течение одного эксперимента управлять большим количеством гранул. Гранулы можно использовать в качестве маркеров для слежения за движением белков, но, очевидно, предпочтительнее визуализировать белки сами по себе. В следующей главе мы увидим, что недавние достижения микроскопии сделали это возможным.
8.3.11. Функционирование белков можно селективно нарушить при помощи малых молекул Химические ингибиторы внесли значительный вклад в развитие клеточной биологии. Например, для анализа того, какие микротрубочки участвуют в данном биологическом процессе, часто используют ингибнтор микротрубочек колхицин; несколько десятилетий назад эта молекула способствовала первому выделению и очистке тубулина.
В прошлом такого рода небольшие молекулы обычно имели природное происхождение, то есть они синтезировались живыми организмами. Несмотря на то что, в целом, природные вещества были невероятно полезны для науки и медицины (см., например, таблицу б.4, стр. 592), они влияли на ограниченное число биологических процессов. Однако недавнее развитие методов синтеза сотен тысяч малых молекул и автоматического широкомасштабного скрининга обещает идентификацию ингибиторов практически всех биологических процессов. В такого рода подходах большие наборы малых химических соединений анализируются одновременно как в живой клетке, так и в бесклеточных системах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
