Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 169
Текст из файла (страница 169)
В основе метода лежат следующие ключевые методы: 1. Расщепление ДНК в специфических сайтах зндонуклсазами рестрикции, значительно ускоряющее изоляцию отдельных генов и работу с ними. 2. Лигирование ДН К, позволяющее проектировать и конструировать молекулы ДНК, не встречающиеся в природе. 3. Клонирование ДНК с использованием либо клонируюших векторов, либо полимеразной цепной реакции, при которой участок ДНК многократно копируется для синтеза миллиардов идентичных молекул. 4. Гибридизация, позволяющая с большой точностью и аккуратностью обна ружить конкретную последовательность ДНК или РНК на основании способности нуклеиновых кислот селективно связываться с комплементарными последовательностями.
5. Быстрая расзнифровка любой последовательности ДНК (даже целых геномов), что позволяет идентифицировать гены и определить аминокислотную по следовательность кодируемых ими белков. б. Одновременное наблюдение за уровнем синтезируемой каждым геном в клетке РНК при помощи нуклеотидных микрочипов, в которых одновременно происходят десятки тысяч реакций гибридизации. В данном разделе мы опишем каждый из зтих базовых методов, радикалыю изменивших область исследования клеточной биологии.
8.4.1. Рестриитазы разрезают больгцие молекулы ДНК на гррагаленты В отличие от белков, гены в клетке не существуют как отдельные единицы, они представляют собой маленький участок значительно более длинной молекулы ДНК. Несмотря на то что молекулы ДНК в клетке могут быть случайным образом разрушены механической силой, участок, содсржаший единственный ген генома млскопитаюшего, будет лишь одним из сотни тысяч (или даже больше) фрагментов ДНК, в среднем не различающихся по размеру. Как выделить такой ген? Поскольку Таблица 8.3. Основные этапы раэеигил метода рехомбинангных ДНК и грансгенных технологий :яви:;:;:;.
':й)йегсйепвг)ереьге вьгйеляйтднкий беяйх хрггвлних тг)ге!ьгюлуцейнйх иэ пропй- ':фЦ-',; ' Авагйдсэгаэыйа)етцтоДй(гЕНЕбеиж,'яии)етсрносктеремгенйт1Ичесхрйинфайгаагх)и' еч врйияйипереаяьгиойтзрпйсформации ;-:1%5. ',;: йхмййвтйОтяРВИаетДИКПОЯИМЕРаЭУ ГРЕРЭГЕ)П КОТОРЫйВНаьтОЯЩЕЕВ)18ЫГВТИСПРПтн зухгтдпй сеэданилйргепсарсазтоегыечеиьой ДНК 822 Часть 111. Методы 1961 1962 1967 1972-1973 1975 1975-1977 1981-1982 1985 1987 1989 1990 1991 1995 1996 1996-1997 1998 2001 Мамии г и Опту открывают ренатурацию ДНК и показывают специфичность и реал и- зуемость реакций гибридизации нуклеиновых кислот Агьег получает первые доказательства существования эндонуклеаз рестрикции ДНК что приводит к их выделению и использованию для описания последовательностей ДНК НатЬапз и Н.
5птЬЬ Н! гепЬепь ОсЬоа и КЬогапа расшифровывают генетический код Ое!!егт открывает ДНК-лигазу, ферменг. используемый для сшивания фрагментов ДНК друг с другом Сотрудники лабораторий Воуег, СоЬеп и ВегВ, а также их коллеги в Университете Стэнфорда и Университете Калифорнии в Сан-франциско, разрабатывают методы клонирования ДНК 5оггтЬегпдляобнаруженияспецифических последовательностейДНК разрабатывает метод гель-электрофореза и переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации 5апдег и Вагге) и Макагп и Я!Ьегз разрабатывают методы быстрого секвенирования ДНК Ра!птйег и ВИпзгег получают тра нсгенных мышей; Вргахй!пд и ВмЫп — трансгенных фруктовых мушек В Национальной лаборатории в Лосдламосе создается бепВвпй — общедоступная база данных генетических последовательностей, поддерживаемая Национальным институтом здоровья США (Набопа! !пзбпите о( Неа((Ь, МН) МпВЬ и его сотрудники разрабатывают метод цепной полимеразной реакции (ПЦР) СаресеМ и 5гпЬМез представляют метод направленной замены генов в эмбриональных стволовых клетках мышей Р)ей!з и 5опВ разрабатывают метод дрожжевых двугибридных систем для идентификации и исследования белковых взаимодействий 01мгп и его коллеги описываютДНК-маркирующие сайты, уникальные последователь- ности ДНК, используемые для составления физических карт человеческих хромосом Мргяап и его коллеги выпускают 8(А5Т вЂ” алгоритм поиска гомологии среди последовательностей ДНК и белков 5!юоп и его коллеги изучают, как эффективно использовать бактериальные искусственные хромосомы (Вас1епа! Агббс!а! СЬгогпозогле, ВАС) для переноса больших фрагментов клонированной человеческой ДНК при секвенировании Ноог) и Нпп1гарй1аг представляют новую автоматизированную технологию секвенирования ДНК 1(епзег и его коллеги впервые секвенируют целый геном.
Это геном бактерии НоеглорИиз!лбиепгае Ообеам и международный консорциум ученых объявляют о завершении проекта по расшифровке первого эукариотического генома дрожжей 5ассвагоглусез сегег)з)ае 1хкЬЬагг и его коллеги Вгошп и ОеМм создают ДНК-чипы, позволяющие одновременно наблюдать за тысячами генов 5ц1зтоп и ууазегэзоп и их коллеги получают первую полную последовательность генома многоклеточного организма, круглого червя СаелогйаЫ!1)ге)едапз Консорциум ученых объявляет о получении предварительной последовательности человеческого генома Публикация «конечной» последовательности человеческого генома 824, Часть 111.
Методы ТААТ ТТАА Адтт Ш 5' ТТАА ггт"~ ~ ~ ~~3' Рис.5.32. Применение зндонуклеаз рестрикции для получения легко соединяемых друг с другом фрагментов ДНК. Фрагменты с одинаковыми липкими концами можно легко соединить за счет комплементарного спаривания нуклеотидов на их липких концах.
В данном примере два сшивающихся друг с другом фрагмента ДНК получены при помощи рестриктазы Есоя!, тогда как три других фрагмента — при помощи других рестриктаз, дающих другие липкие концы (см. рис. В.32). Фрагменты с тупыми концами, получающиеся, например, при использовании Нра! (см. рис. 3.31), сшить друг с другом сложнее. ААТТ У 5' 5' 3' ТТАА соединения двух или более фрагментов з' ДНК.
носят название рекомбинантных ТААТ молекул ДНК. А ТАТ ~-ч ч~-ч-н 3' .) 1-1-4-1.5. 8.4.2. ) елгз-злектрофорез ТТА А 3~ 15' ДЙК рвзлйчиьгх рвзвлвроВ Методы гель злекгрофореза, под твердившие свою полезность для анализа белков, точно так же позволяют определить длину и чистоту молекул ДНК.
Процесс даже проще, чем в случае белков: поскольку каждый нуклеотид в молекулах нуклеиновых кислот изначально несет один отрицательный заряд (па фосфатной группе), нет необходимости добавлять отрицательно заряженный дсгергент ДОН, который нужен для того, чтобы моле кулы белков двигались в сторону положительного электрода. Дляфрагментов ДНК длиной менее 500 нуклеотидов, разработаны специальные полиакриламидные гели, позволяющие разделя гъ молекулы, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид (рис.
8.33, а). Однако поры в полиакриламидных гелях слишком малы для того, чтобы пропускать очень большие молекулы ДНК; для разделения крупных моле кул из разбавленных растворов атаровы (полисахарида, выделяемого из морских водорослей) делают Гюлее пористые гели (рис. 8.33, б). Эти методы разлеления ДНК широко используют как для аналитических, так и препаративных целей. Одна из разновидностей электрофореза в агарозном геле — гель.электрофореэ в градиенте пульсируюя(его поля, позволяя>щий разделять даже очень длинные молекулы Д11К.
Обычный гель электрофорез не способен идентифицировать такие молекулы, потому что постоянное электрическое поле заставляет их вытягиваться таким образом, что они движутся через гель концом вперед в змеевидных кон. фигурациях со скоростью, не зависящей от их длины. При гель электрофорезе в градиенте пульсируюгцего поля направление электрического поля периодически меняется, что заставляет молекулы переориентироваться, прежде чем они продолжат свое змеевидное движение через гель. Такая переориентация длится гораздо долыпе в случае крупных молекул, поэтому длинные молекулы движутся медленнее, чем короткие. В результате даже целые бактериальные или дрожжевые хромосомы в геле с градиентом пульсирующего поля разделяются на отдельные полосы, и становятся возможными их классификация и идентификация на основе размера (рис.
8.33, в). 8.4.Анализ И Манннуляцни с ДНИ ' Зхб дорожки 1234 Рис. 8.33. Методы гель-электрофореза для разделения молекул ДНК по размеру. В трех приведенных примерах зле ктрофореэ проходит сверху вниз, поэтому самые крупные молекулы ДНК (и поэтом у самые медленные) располагаются вверху геля. а) Для разделения одноцепочечной ДНК использовали полиакриламидный гель с маленькими порами. Молекулы ДНК, состоящие из 10-500 нуклеотидов, можно разделить по размеру с точностью до одного нуклеотида. В данном примере четыре полосы представляют собой наборы молекул ДНК, синтезированных во время ее секвенирования. Секвенируемую ДНК искусственно реплицировали с фиксированного сайта до различных конечных точек, что дало набор частично совпадающих молекул разной длины. (На рис. 8.50 показан синтез таких частичных реплик.) На дорожках 1-4— все частичные реплики, оканчивающиеся на б, А, Т и С ссютветственно.
Поскольку в этих реакциях использовали радиоактивно меченые молекулы ДНК, их положение можно определить при помощи радиоавтографии. б) Для разделения двухцепочечных молекул ДНК использовали агарозный гель с порами среднего размера. Эти молекулы ДНК представляют собой фрагменты, полученные путем расщепления вирусного генома рестриктазами. Полосы зарегистрированы благодаря флуоресценции красителя бромида этидия. е) Для разделения шестнадцати дрожжевых хромосом, длина которых колеблется в пределах от 220 тыс.
до 2,5 млн. л. н., использовали метод гель-электрофореза в градиенте пульсирующего поля. ДНК окрашена, как на (б). Этот метод позволяет разделить молекулы ДНК длиной до 10" и. н. (С любезного разрешения ).еапоег Саибег и Ре1ег ЬУаиег (а); Кеп Кгеигег (б); О. Чойгагб ап6 й. ту. оачи, Л(ис(его Ясгвз Яез. 15: 7865-7876, 1987. С любезного разрешения Ох(огб Опыегяту Ргезз (е).) 6000 нукпеотидные б) 1000 -к Иг,— 100 50 МГ- хь 2.5 миллиона ч тн о 48 '3 105 4. в) 950 000 нуклеотидные пары 610 000 220 000 Несмотря на то что типичная хромосома млекопитвтощих, состоящая из 10" п. н., слишком велика для очистки этим методом, большие участки этих хромосом легко разделяют и идентифицирукл, если предварнзельно хромосомную ДНК обработать рестриктазами, расщепляющими ДНК по редко встречающимся сайтам (единожды на каждые 10 тыс. или более нуклеотидных пар).
Полосы ДНК в агарозном или полиакриламидном геле невидимы, если ДНК не была окрашена или помечена. Один из наиболее чувствительных методов окра шивания ДНК вЂ” обработка ее красителем бромидом этидия, который при связы ванин с ДНК флуоресцирует в ультрафиолете (см. Рис. 8.33, б, в). В еще более чувствительном методе детекции до электрофореза в молекулу ДНК включают радиоизотоп; часто используют 12Р, поскольку его можно включить в фосфатные группы ДНК, и он испускает высокоэнергетическую )) частицу, которую легко зарегистрировать радиоавтографией, как на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
