Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 170
Текст из файла (страница 170)
8.33 (описание радиоизотопов см. в разд. 9.1.16). 826 Часть В. Методы б) очищенный фрагмент рестрикции ДНК 5' , . . . 3' з' зз гаг ~Р),Р'~-А ДНК, меченая по 5'-концам попинукпеотидкиназой ' РГ-;Г. *-А посргпстаом меченого Р АТР а) очищенный фрапкент рестрикции ДНК 5', . . ., , , 3' ! денатурация и отжиг со смесью гексанукпеотидов ! рестриктаза расщепляет спираль ДНК на два неравных фрагмента ! добавление ДНК-полимеразы и мечены» нукпестидов разделение гель-злекгрофорезом 3' 5 кз)гйгаувву)бЬ з 3' ' 5' ДНК-гюпимераза включает меченые нуклеотиды а цепь В результате жюучается множество молекул ДНК, сгщержащих меченые образцы всех последовательностей на обеих цепях нужный фрагмент дНК, одна из цепей которого сгазержит метку на одном конце е) о О участок асс еще доступен для комплементарного связывания с А О )! Π— Р— О Он Рис.
8.34. Методы мечения молекул ДНК )л оаго. а) Очищенный фермент ДНК-полимераза метит все нуклеотиды в молекуле ДНК, таким образом синтезируя высокорадиоактивные ДНК-зонды. б) Полинуклеотидкиназа метит только 5сконцы цепей ДНК; поэтому, когда за мечением следует расщепление эндонуклеазами рестрикции, можно быстро выделить единственную меченую по 5цконцу цепь. е) Метод на )а) также используют для синтеза нерадиоактивных молекул ДНК, несущих специфический химический марнер, который можно обнаружить при помощи соответствующего антитела. Показанный на рисунке модифицированный нуклеотид в ДНК может быть введен ДНК-палимеразой, что позволяет молекуле ДНК служить легно обнаруживаемым зондом.
Показанное на рисунке основание на нуклеозидтрифосфате является аналогом тимина, в котором метильная группа на Т заменена спейсерной группой, связанной с растительным стероидным гормоном дигоксигенином. чтобы визуализировать зонд используют антитело иди гокси ген пну, связанное с видимым марнером, например флуоресцентным красителем. К нуклеотидам с тем же результатом можно присоединить и другие химические метки, например, биотин. 8.4.Анализ и манипуляции с ДНК 827 8.4.3. Очиц4емные молекулы ДНК можно слецифичесии метить лри лОмОгци раДИОизОтОПОВ или химических мариерОВ 1л гг(ФГО Для мсчения изолированных молекул ДНК широко используют два метода.
В первом ДНК полимераза копирует ДНК в присутствии радиоактивных (обычно меченных фосфором ззр) или химически маркированных нуклеотидов (рис. 8.34, а). Это позвсшяет получать для реакций пгбридизапии нуклеиновых кислот (описан ных ниже) «зонды Д11К», содержащие множество меченых нуклеотидов. Во втором фермент бактериофагов полипуклеотидкипаза переносит единственный меченный з~р фосфат с АТР на 3' конец каясдой цепочки ДНК (рис. 8.34, б). Поскольку киназа вставляет в каждую цепь ДНК только один атом зар, меченные таким образом мо лекулы Д11К часто недостаточно радиоактивны, чтобы их можно было использовать в качестве зондов.
Однако, поскольку они мечены только с одного конца, их можно использовать в других методах, включ;и футпринтинг ДНК, описанный в главе 7. Методы радиоактивного мечення постепенно замещанзт мсчснием молекулами, которые можно обнаружить химически или с помощью флуорссценции. Для по лучения таких нерадиоактивных молекул ДНК, исполь.гукгт специально модифи цированные предшественники нуклеотидов (рвс. 8.34, в). Синге,шрованная таким образом молекула ДНК может связываться с комплсмснтарной нослсдоватсльностькг ДНК путем гибридизации, как описано в следующем разделе.
Затем ее детектирукл при помощи антитела (нли другого лиганда), специфически распозиаюпгего ее модифицированнук> боковую нспь (рис. 8.38). 8.4,4. Реакции гибридизации нуклеиновых кислот — чувствительный способ обнаружении специфических последовательностей нужлеотидОВ Когда водный раствор ДНК нагревают до 100 'С или подвергатот действию очень высокого РН (рН . ! 3), компле ментарные п.н., которые в нормальных условиях держат вместе испи двойной спирали ДНК, разрушаются, и двойная спираль быстро диссоциирует на две одиночные цепочки.
Эгот процесс, но Рис. В.З5. Гибридизация гл зло для определения местоположения определенных генов в хромосомах. Здесь для маркирования мест расположения соответствующих нуклеотидных последовательностей на хромосоме 5 человека в метафазе использовали шесть различных ДНК-зондов. Зонды метили химическим путем и обнаруживали при помощи флуоресцирующих антител. Показаны обе копии хромосомы 5, расположенные рядом. Каждый зонд дает две точки на каждой хромосоме, так как метафазная хромосома реплицировала свою ДНК и содержит две идентичные спирали ДНК.
(С любезного разрешения ватка С. Ъуага) 828 Часть 111. Методы сящнй название депатурации ДН К, много лет считали необратимым. Однако в 19б! г. обнаружили, что комплементарные одиночные цепи Д1! К легко восстанавливают двойные спирали в результате процесса, называющегося гибридизацией (или ренатурацией ДНК), если их держать продолжительное время при температуре б5 'С. Сходные реакции гибридизации могут протекать между любыми двумя одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (ДНК~'ДНК, РНК,'РНК или РНК,'ДНК) при условии, что они обладают комплементарными последовательностями нуклеотндов.
Такие специфичные реакции гибридизации широко применяются для обнаружения и характеристики определенных нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК. Одноцепочечные молекулы ДНК, используемые для обнаружения комплементарных последовательностей, называются зондами; длина этих молекул, несущих радиоактивные нлн химические метки для упрощения нх обнаружения, колеблется в пределах от пятнадцати до нескольких тысяч нуклеотидов. Реакции гибридизации с использованием ДНК-зондов настолько чувствительны н селективны, что они позволяют обнаружить комплементарные последовательности, концентрация которых не превышает одной молекулы на клетку. Таким образом, можно определить, сколько копий любой последовательности ДНК содержится в данном образце ДНК. Подобный метод можно использовать для поиска родственных, но не идентичных генов. Например, чтобы найти интересующий ген в организме, чей геном не был еще секвенирован, в качестве зонда можно исполыювать часть известного гена (рпс.
8.36). С другой стороны, ДНК-зонды можно использовать в реакциях гибридизации с РН К, а не ДН К. Это позволяет определить, экспрессирует ли клетка конкретный ген. В этом случае зонд, содержащий участок последовательности гена, гибридизуют с РНК, выделенной из интересующей клетки, и смотрят, содержатся лн в РНК нуклеотидные последовательности, совпадающие с ДНК-зондом, и если да, то в каких количествах. В более трудоемких методах после окончания гибридизации ДНК-зонд подвергают действию специфических нуклеаз для точного нахождения участков зонда, связавшихся с молекулами РНК.
Таким образом, можно определить сайты начала и окончания транскрипции РНК, а также точные границы интронных и экзонных последовательностей в гене (рнс. 8.37). Сегодня расположение границ интронов экзонов обычно определяют прн помощи секвенирования комплементарнь х последовательностей ДНК ( кДНК), которые отражают состав экспрессируемых в клетке мРНК, н сравнения их с нуклеотидной последовательностью генома. Мы ниже опишем, как из мРНК получают кДНК. Гибридизация ДНК-зондов с РНК позволяет определить транскрибируется лн определенный ген. Более того, когда экспрессия гена изменяется, можно определить, вызвано ли изменение транскрипционной или постгранскрипционной регуляцией (см.
Рис. 7.92). Анализ экспрессии генов сначала проводили с одним ДНК-зондом. ДНК-чипы в настоящее время позволяют одновременно следить за сотнями и тысячамн генов (рассмотрим этот метод позже). Сегодня методы гибридизации настолько широко применяют в клеточной биологии, что уже трудно представить, как мы могли бы исследовать структуру и экспрессию генов без них. 8.4.5. Нозерн-блоттинг и Саузерн-блоттинг ускоряют гибридизацию с разделенными злектрофорезом молекулами нуклеиновых кислот В сложной смеси нуклеиновых кислот ДНК-зонды часто используют для обнаружения только тех молекул, чьи последовательности частично или полностью комплементарны зонду.
Перед началом реакции гибридизации прн помощи гель- 84.Анализ нманнпупяцннсДН(Е 829 одноцепочечные ДНК-зонды для гена в смесь одноцепочечных гибридизация в 50%-м формадиде при 42 'С гибридизация в 50%-м формадиде при 35 'С неполное спаривание оснований талька А.формирует ' стабильную двойную спираль А; С и Е формируют стабипьныв двойнью спирали Рис.
8.36. Жесткие и мягиие условия гибридизации. Для нахождения с помощью ДНК-зонда точного совпадения используют жесткие условия гибридизации. Температуру поддерживают таким образом, чтобы она была на несколько градусов меньше, чем температура, при ноторой идеальная спираль ДНК денатурирует в данном растворителе (темлературо плавления).
В результате все образующиеся неидеальные двойные спирали нестабильны. Менее жесткие условия используют, когда ДНК-зонды применяют для обнаружения как близких, так и идентичных последовательностей. Гибридизацию проводят при более низкой температуре, что позволяет образовываться и неидеальным двойным спиралям. Только в условиях пониженной температуры гибридизацию можно применять для поиска пенде нгичных, но сходных с генам А генов (С и Е в данном примере). электрофореза можно разделить по размеру все различные молекулы Р11К или ДПК в необработашюй смеси. Если зонд связывается с молекулами только одного или нескольких разме)юв„можно быть уверенным, по гибридизация специфична. Более того, информация о размерах молекул сама по себе может оказаться неоценимой.
Приведенный ниже пример иллюстрирует это утверждение, Предположим, что необходимо определить природу дефекта в мутантной мып~и, который приводит к патологически низкому уровню белка альбумина, который обычно в больших количествах секретируегся в кровь клетками печени. Сначала необходимо получить идентичные препараты ткани печени мутантных и нормальных мышей (по следние служат в качестве контроля) и разрушить клетки сильным детергекгом для инактивации нуклеаз, которые в противном случае могут расщепить нуклеиновые кислоты. Затем нужно отделить РНК и ДИК от других компонентов клеточного гомогената: все белки полностью денатурируют и удаляют многократным осаждени- 8.4.
Анализ и манипуляции с ДНК 831 геле путем переноса («блсэтгинга») разделенных молекул РНК на нитроцеллюлозный фильтр или полиамиднукэ бумагу. Фильтр затем инкубируют в растворе, содержащем меченые ДНК-зонды, псэс.зедовательности которых частично соответствуют цепи, кодирующей мРИК альбумзина. Молекулы мРНК, которые будут гибридизироваться с меченым ДНК-зондом нм фильтре (так как они комплементарны части нормальной последовательности ге-..на альбумина), затем локализуют путем обнаружения связанного зонда радиоа.вт ографией или химическими способами (рис. 8.38).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
