Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 167

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 167)

Как только ингнбитор обнаруживается, его можно использовать в качестве зонда для идентификации белка, с которым он связывается. Для этого используют аффинную хроматографию (см. рисунок 8.13, в) н другие сходные методы. Такой подход, часто называемый химической биологией, позволил обнаружить ингибиторы многих ключевых белков, принимающих участие в процессах клеточной биологии. При помощи этого метода, например, идентифицирован белок кинезин, участвующий в митозе (рис. 8.27). Химические ингибиторы дают клеточным биологам возможность контролировать время ингибирования, поскольку лекарства можно быстро добавлять или удалять из клеток, обеспечивая быстрое включение и выключение функции белка.

814 Часть П1. Методы о сн, н в) монастроп с .з 5 мкм в) 5 мкм Рис.8.27. Малые молекулы-ингибиторы для манипуляции живыми клетками. о] Химическая структура монастрола — ингибитора кннезина, обнаруженного путем широкомасштабного скрининга малых молекул, нарушающих митаз. 6) Нормальное митотическое веретено деления, наблюдаемое в интактных клетках. Микротрубочки окрашены зеленым, хромосомы — синим. в) Однополюсное веретено деления, образующееся в клетках, обработанных монастролом.

(б и в из т. ц. Мауег ет а)., 5сгепсе 286: 971 — 974, 1999. С любезного разрешения издательства ААА5.) Основной метод расшифровки трехмерной структуры молекул, включая белки, в атомном разрешении — рентгеновская кристаллография. Рентгеновские лучи, как и свет, представляют собой вид электромагнитного излучения, но они обладают меньшей длиной волны, обычно около О. 1 нм (диаметр атома водорода). Если узкий параллельный пучок рентгеновских лучей направить на образец чистого белка, большинство лучей пройдут прямо насквозь. Однако маленькая их часть будет рассеиваться за счет взаимодействия с атомами в образце. Если проба представляет собой высокоупорядочснный кристалл, расссянныс лучи в определенных точках будут усиливать друг друга, и в специальном детекторе они будут отображаться как дифракционные пятна (рис.

8.28). 8,3, Анализ белков 81 5 попуч белка внная рентгенограмма ваго кристалла -:.Ъ""---:: рассеянные пуч белковый кристалл пучок рентгеновских лучей остановка и ка луч источник рентгеновского излучения а) б) в) Рис. 8.28. Ренттеноструктурный анализ. а) Узкий пучок параллельных рентгеновских лучей направляют на высокоупорядоченный кристалл.

б) Здесь показан кристалл белка рибулозотчрбифосфаткарбоксилазы, фермента, играющего центральную роль в фиксации СО при фотосинтезе. Атомы кристалла рассеивают некоторые лучи, и рассеянные волны усиливают друг друга в определенных точках, регистрируемых в качестве дифракционных пятен (в).

Зта днфракционная картина и аминокислотная последовательность белка могут быть использованы для получения атомной модели (г). Полноатомную модель сложно интерпретировать, но ее упрощенный вид, полученный из данных рентгеновской дифракции, наглядно демонстрируетструктурные свойства белка (а-спирали показаны зеленым, )3-листы — красным). Компоненты на рисунках а-г показаны не в масштабе. (с любезного разрешения С. Вгапдеп (б); Ь На)да и Ь Апдегзтоп (а); адаптировано из оригинала, предоставленного В. Ригцбгеп (г).) а~гв ~~ф1т у Положение и интенсивность каждого пятна на изображении рентгеновской дифракции дают ипформацшо о положении атомов, вызвавших рассеяние лучей.

в кристалле. Расшифровка трехмерной структуры большой молекулы — это сложная задача. Она не была разрешена вплоть до 1960 г. Но в последние годы рентгеноструктурный анализ стал автоматизированным, и сейчас самым медленным шагом обычно бывает получение подходящих кристаллов белка.

Для этого необходимы большие количества очень чистого белка, и часто на нахождение правильных условий кристаллизации уходят годы проб и ошибок. Скорость значительно увеличилась по. еле начала использования метода рекомбинантных ДНК для получения чистого белка и робопгэированных методов анализа большого числа условий кристаллизации.

Анализ получившейся дифракционной картины дает сложную трехмерную карту электронной плотности. Интерпретация этой карты — перевод ее контуров в трехмерную структуру — представляет собой сложный процесс, требующий знания аминокислотной последовательносги белка. Обычно методом проб и оши Гюк последовательность и карта электронной плотности соотносятся друг с другом 816 Часть Ш. Методы на компьютере с получением наилучшего совпадения. Надежность получившейся атомной модели зависит от разрешения исходных кристаллографических данных: разрешение 0,5 нм может дать слабое разрешение полипептидной цепи, тогда как при 0,15 нм можно надежно предсказать положение всех не водородных атомов. Полная атомная модель часто ели<иком сложна, для того чтобы рассматривать ее напрямую, поэтому ее обычно представляют в качестве упрощенной версии, демонстрирующей основные структурные свойства белка (см. приложение 3.2, стр.

200 — 201). На данный момент методами рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии (см. ниже) расшифрованы трехмерные структуры около 20 тысяч различных белков. Этого оказалось достаточно для обнаружения семейств часто встречаемых структур. Эти структуры или способы сворачивания белков часто в течение эволюции остаются неизменными, в отличие от образуюгцих их аминокислотных последовательностей (см. рис. 3.13). Мегоды рентгеновской кристаллографии также можно применять для изучения макромолекулярных комплексов. Последнее великое достижение — эго расшифровка структуры рибосомы, большой и сложной машины, состоящей из нескольких молекул РНК и более 50-ти белков(см.

рис. б.б4). Расшифровка потребовала использования синх1ютрона — источника рентгеновских лучей, интенсивность которого достаточно велика для анализа кристаллов такого крупного макромолекулярного кол<плекса. 8.3.13. Использование ЯМР для расшифровки структуры белка в растворе Ядерную магнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию много лет широко используют для анализа структуры малых молекул. Этот метод сейчас все чаше применяют для изучения небольших белков или белковых доменов. В отличие от рентгеноструктурного анализа, для ЯМР не нужен кристаллический образец.

Все, что необходимо, "- это небольшой объем концентрированного раствора белка, помещаемый в сильное магнитное поле. ЯМР является основным методом получения подробной информации о трехмерной структуре молекул в растворе. Определенные ядра атомов, в особенности водородные ядра, обладают магнитным моментом или спином, то есть они обладают внутренней намагниченностью, как стрежневой магнит. Спин ориентируется вдоль направления сильного магнитного поля, но его можно перевести в хаотическое возбужденное состояние под воздействием радиочастотных импульсов электромагнитного излучения. Когда возбужденные ядра водорода возвращаются в исходную ориентацию, они испускают радиочастотное излучение, которое можно измерить и выразить в виде спектра.

Природа испускаемого излучения зависит от окружения каждого атома водорода, и если одно ядро возбуждено, то оно будет влиять на поглощение и испускание других близлежащих ядер. Затем при помощи искусного применения базового метода ЯМР, известного как двумерный ЯМР, можно различить сигналы водородов различных аминокислотных остатков и измерить малые смещения в этих сигналах, происходящие, если эти ядра водородов лежат достаточно близко для взаимодействия. Поскольку величина этих смещений указывает на расстояние между взаимодействующими парами водородных ядер, метод ЯМР способен давать информацию о расстояниях между частями белковой молекулы.

Совмещение этих данных с аминокислотной последовательностью позволяет рассчитать трехмерную структуру белка (рис. 8.29). 6;3, Анализ белков 817 Рис. 8.29. ЯМР-спектроскопия. о) Пример данных, полученных при помощи установки ЯМР. Данный двумерный спектр ЯМР получен для С-концевого домена фермента целлюлозы. Пятна показывают взаимодействие между ядрами водорода, лежащими в белке вблизи других водородных атомов, и, значит, можно определить расстояния, разделяющие ядра. Сложные вычислительные методы в сочетании с известной аминокислотной последовательностью позволяют получить согласующиеся структуры, б) Показана суперпозиция десяти структур фермента, равно удовлетворяющих ограничениям на расстояния.

Такое представление дает достаточную информацию о возможной трехмерной структуре. (С любезного разрешения Р. Кгаиик) В связи с техническими ограничениями ЯМР спектроскопия позволяет хорошо определять только структуру маленьких белков с молекулярной массой до 20 кДа.

Разрешение падает с увеличением размера макромолекулы. Но последние техни ческие разработки увеличили предел до 100 кДа, что сделало ЯМР спектроскопию доступной для структурного анализа большинства белков. Поскольку ЯМР требует использования растворов веществ, данный метод также подходит, например, для наблюдения за изменением структуры белков при фолдинге или связывании белком другой молекулы.

ЯМР также широко примегиют для исследования отличных от белков молекул, он очень полезен, например, в качестве метода определения трехмерной структуры молекул РНК и сложных углеводных боковых цепей гликопротеинов. Некоторыс основные этапы развития ренттеноструктурного анализа и ЯМР.спектроскопии перечислены в таблице 8.2. ЗЗ.14. ЙоспеДоиатепьмость и структура бенка могут указать ми его функз1ииз Обсудив методы очистки и анализа белков, обратимся к обычной ситуации в клеточной и молекулярной биологии -- исследователь идентифицировал важный для биологического процесса ген, но не знает биохимических свойств его белкового продукта. 818 Часть 81.

Характеристики

Список файлов книги