Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 164
Текст из файла (страница 164)
гоптюза апс) В. М. А)ьеггз,х Вюг Сбелз. 261: 6107-6118, 1986.) 1 2 3 4 5 молекулярная масса (дапьтоны) 100 000 40 000 ДС)1 ПААГ широко применяют, так как он позволяст разделить любые типы белков, включая те, которые в нормальных условиях в воде нерастворимы, например мембранные белки. Поскольку полипептиды разделяются по разьсеру, метод позволяет судить о молекулярной массе и субье диничном составе белков, 11а рис.
8.18 представлена фотография геля. использо. ванного для анализа каждого этапа очистки белка. — 15 000 8,3.3. Масс-спектрометрия является высокочувствительным методом идентификации неиавестньах белков Клеточные биологи и биохимики часто сталкиваются с задачей идентификации одного или нескольких белков, полученных одним из ранее описанных методов очистки (см., например, рис. 8.16). Поскольку геномы наиболее распространенных экспериментальных организмов расшифрованы, сусцествуют каталоги всех синтезируемых в этих организмах белков. Это упрощает задачу идентификации неизвестного белка (или набора неизвестных (телков), так как теперь необходимо лишь сравнить некоторые из содержащихся в образце аминокислотных последо- 8.3.2, Специфические белки можно обнаружить путем гибридизации с антителами Определенный белок можно идентифицировать после фракционирования в ПААГ путем экспонст)ювассия всех присутствуклцих в геле белков к специфическому анти телу, связанному с радиоактивным изотопом, легко репютрируемым ферментом или флуоресцентным красителем.
Для удобства все разделенные белки, находящиеся в геле, сначала переносят (путем «промокания», отсюда английский термин «блот тингь) на нитроцеллюлозную бумагу или нейлоновую мембрану. После помещения мембраны на гель налагаот сильное электрическое поле, которое заставляет белки выходить из геля и переходить на мембрану. Затем мембрану вымачивают в растворе меченого антитела, что позволяет обнаружип нужный белок. Этот метод обнаружения белков называется вестерн-блоттинг, или иммуноблоттинг (рис.
8.20). 802 Часть 1!1, Методы 4Й~ !щзвг м ь ." '-е'вч~г:. чейза!488 и ев в) б) Ри». 8.20. Вестерн-блоттинг. Все белки из делящихся клеток табака в культуре сначала разделяют при помощи двумерного злектрофореза в полиакриламидном геле (метод описан на рисунке 8.23). на (а) положение белков определено при помощи чувствительного белкового красителя.
На (б) разделенные в одинаковом геле белки перенесены на лист нитроцеллюлозы и зкспонированы к антителу, специфичному к белкам, фосфорилированным во время митоза по остаткам треонина, Положение порядка дюжины белков, с которыми связалось данное антитело, определяют при помощи связанного с ферментом второго антитела. Этот метод также иногда называют иммуноблоттингом (нли вестернблоттингом].
(Из Ь Я. Ггааз ет а!., Ргапт2 2: 723-732, 1992. С любезного разрешения В(асмане(! Роыьмпз.) вательностей с известными генами. В настоящее время для этого практически по всеместно применяют масс спектрометрию в сочетании с компьютерным поиском по базам данных. Динамика заряженных частиц под действием электрического и магнитного полей в вакууме подчиняется строгим законам. Этот принцип используют в масс спектромегрии для разделения ионов в зависимости от отношения их массы к заряду. Это невероятно чувствительный метод.
Для него требуется очень малое количество вещества, и он позволяет определять точную массу интактных белков и пептидов, полученных путем ферментативного или химического расщепления. Полученные массы очень точны; часто ошибка меньше чем одна миллионная. Наиболее рас. пространенный вид данного метода — это матричноактивгтрованная лазерная десорбция ионизация с нрелгяпролетным масс анализатором (МА)Р! ТОН. При этом подходе содержащиеся в образце белки сначала расщепляют до коротких пептидов. Эти пептиды затем смешивают с органической кислотой н высушивают на металлической или керамической подложке. Затем образец облучают лазером, и пептиды цокидакзт подложку в виде ионизированного газа, в котором каждая молекула несет один или более положительных зарядов. Ионизированные пептиды ускоряются в электрическом поле и летят в сторону детектора.
Их масса и заряд определяют время, за которое они достигнут детектора: большие пептиды движутся медленнее, а частицы с болыпим зарядом - - быстрее. Анализируя такие ионизированные пептиды, несуп!ие единственный заряд, можно определить точную массу содержащихся в исходном образце пептидов. МА1.Р1-ТОг также можно использовать для точного определения массы интактных белков массой до 200 тысяч кДа.
Полученную информацию затем используют для поиска по геномным базам данных, в которых содержатся массы всех белков и их предполагаемых пептидных фрагментов, полученные из последовательности генома организма (рис. о.21, а). Одно значное совпадение с определенной открытой рамкой считывания можно получить, зная массу лишь нескольких пептидов, входящих в состав данного белка.
МА1 Р! ТОг позволяет получить точную молекулярную массу белков и пептидов. Более того, используя одновременно два масс спектрометра (такое сочетание ВЗ. АНаЛИЗ бВЛКОВ 8(8 интересующий белок Ы, ПОЛУЧЕННЫЕ АСЩЕПЛЕНИЯ НОМ, ИХ МАССУ ЮТ ПРИ ПОМОЩИ ПЕКТРОСКОПИИ Р МАСС-СПЕКТРОМЕТР ДАЕТ МАССЫ ПЕПТИДОВ, КАК НА (а) ~~ ДАЛЬНЕЙШЕЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ яаквь ПЕПТИДОВ ПО ПЕПТИДНЫМ им'хьм СВЯЗЯМ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАССЫ ФРАГМЕНТОВ ИЗМЕРЯЮТСЯ НА ВТОРОМ СОПРЯЖЕННОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРЕ (МСГМС! — ИВК((к -Вфг-Бег-Аэп В(В- тэз 55 1 15 ез 1 05 1295 555 200 т(2 (отношение массы к заряду) 1 500 а) Рис.8.21.
Использование масс-спектромвтрии для идентификации белков и секеенирования пептидов. Выделенный белок расщепляют трипсином, и пептидные фрагменты помещают в масс-спектрометр. Далее для идентификации белка можно использовать два подхода. а) В первом методе массы пептидов определяют напрямую при помощи масс-спектрометрии МАЬО1-ТОЕ Затем поиском по базам данных находят ген, кодирующий белок, чей расчетный профиль расщепления трипсином совпадает с полученнымии значениями.
б) Масс спектрометрия также позволяет напрямую определить а мин окисл отную последовательность пептидных фрагментов. В данном примере триптические пептиды сначала разделяютт в масс-спектрометре в зависимости от массы. Затем каждый пептид еще больше фрагментируется, в основном путем расщепления пептидных связей.
В результате получается вложенное множество пептидов, различающихся по размеру на одну аминокислоту. Зти фрагменты помещают во второй сопряженный масс-спектрометр и определяют их массу. Разность масс двух близко связанных пептидов можно использовать для определения «лншней» аминокислоты.
Посредством последовательного повторения этой процедуры можно определить частичную аминокислотную последовательность исходного белка. Для наглядности показан анализ образца из одного очищенного белка. На самом деле, масс-спектрометрию обычно применяют для смеси белков, полученных, например, для аффинной хроматографии (см. рис.8.16), это позволяет идентифицировать все присутствующие в смеси молекулы. Более того, масс-спектрометрия способна также определять поапрансляционные модификации белков, как описано в тексте.
! 0 пуз (отношение массы к заряду) 1 000 ПО БАЗАМ ДАННЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ БЕЛКОВ ИЩУТ СОВПАДЕНИЯ С ТЕОРЕТИЧЕСКИМИ МАССАМИ, РАССЧИТАННЫМИ ДЛЯ ВСЕХ ТРИПТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА РАЗЛИЧИЯ ПО МАССЕ МЕЖДУ ФРАГМЕНТАМИ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ ДЛЯ ВОССОЗДАНИЯ ЧАСТИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. ЭТИ ДАННЫЕ ПОЗВОЛЯЮТ ИДЕНТИФИЦИРОВАТЬ ГЕН ИЛИ ПОМОЧЬ В РАЗРАБОТКЕ МЕТОДОВ ЕГО КЛОНИРОВАНИЯ 804 Часть 111. Методы носит название МС,'МС), можно напрямую определить амииокислотиую последовательиость отдельных пептидов в сложной смеси. Как описано выше, образец белка сначала расщепляют иа пептиды меньшего размера, затем разделяют при помощи масс-спектрометрии.
Каждый пептид затем фрагмеитируется еще больше за счет столкиовеиия с высокоэнергетическими атомами газа. Этот метод фрагментации в основном направлен иа разрушение пептидиых связей, что приводит к образованию «лестиицы > фрагментов, отличающихся иа одну аминокислоту, Во втором масс-спектрометре эти фрагмеить1 разделяют и определяют их массу. Анализируя эти различия в массах, можно восстановить амииокислотиую последовательность пептида (рис. 8.21, 6). МС,~МС очень полезна для нахождения и определения точного положения посттраисляциоиииых модификаций белков, например фосфорилироваиия или ацетилироваиия. Поскольку эти модификации приводят к характерному увеличению массы аминокислоты, их легко детектировать при помощи масс-спектрометрии.
В главе 3 мы говорили, что протеомика — термин, объединяющий множество различных эксперимеитальиых методов, — представляет собой описание всех белков клетки, включая все белок-белковые взаимодействия и посттраисляциоииые модификации. В сочетании с быстрыми методами очистки, описанными в предыдущем ржзделе, масс-спектрометрия стала наиболее могущественным методом нахождения посгграисляциоииых модификаций как данного белка, так и всех белков, связанных с иим в процессе очистки.
8.3.4. Двумерные методы разделения исключительно эффективны Разиьге белки могут обладать одинаковым размером, формой, массой и суммариым зарядом, поэтому большинство методов разделения, таких как гель-электрофорез в полиакриламидиом геле или иоиообмеииая хроматография, обычно неспособны обнаружить все белки клетки или хотя бы оргаиеллы. В отличие от этих методов, двумерный гель-электрофорез, в котором использованы два различных подхода к разделению белков, обладает разрешением в 2000 белков (это общее число различных белков в простой бактерии) иа двумерной карте белков.
На первом шаге белки разделяют по их характерному заряду. Образец растворяют в маленьком объеме раствора иеиоииого (иезаряжеииого) детергеита, содержащего также 1)-меркаптоэтаиол и деиатурирующее химическое соединение— мочевииу. В этом растворе все пептидиые цепи деиатурируют и диссоциируют, ио их собственный заряд при этом ие меняется. Полипептидиые цепи затем разделяют в градиенте рН при помощи метода изоэлектрического фокусирования, основанного иа изменении суммарного заряда молекулы белка в зависимости от рН окружающего раствора.
Каждый белок имеет характерную изоэлектрическую точку, то есть рН, при котором ои ие несет суммарного заряда и, следовательно, ие движется в электрическом поле. При изоэлектрическом фокусировании белки электрофоретически разделяют в узкой трубке полиакриламидиого геля, в котором при помощи смеси специальных буферных растворов задают рН. Каждый белок движется в градиеите до места, соответствующего его изоэлектрической точке, и останавливается там (рис. 8.22). Это первое пространственное измерение двумерного электрофореза в полиакриламидиом геле.
На втором шаге узкий гель, содержащий разделенные белки, вновь подвергают электрофорезу, ио в перпендикулярном относительно первого шага иаправлеиии. В этот раз добавляют ДСН, и белки разделяют в соответствии с их размером, как в одномерном ДСН-ПААГ; исходный узкий гель вымачивают в ДСН и помещают иа край пластины полиакриламидиого геля с ДСН, через который будут мигрировать 806 Часть )И. Методы основной — — стабильный градиент рН кислотный Рис. В.23.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
