Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 159

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 159)

8.1. Выделение и выращивание клеток в культуре Несмотря на то что органеллы и большие молекулы в клетке можно увидеть при помощи микроскопа, чтобы понять, как опи работают, необходим детальный биохимический анализ. Большинство биохимических методов требует физического разрушения большого количества клеток для получения доступа к их компонентам. Если в качестве пробы берется образец ткани, состоящий из различных типов клеток, неоднородные клеточные популяции будут смешаны между собой. Чтобы получить как можно Гюльше информации о клетках ткани, биологи разработали способы выделения клеток из ткани и разделения их по типам.

Эти приемы позволяют получить относительно однородные популяции клеток, которые можно уже анализировать либо напрямую, либо после значительного увеличения их количества за счет пролиферации в культуре. 8.1.1. Клетки можно выделить из интактных тканей Интактные ткани представляют собой наиболее приближенный к реальной живой системе источник материала, так как онн дают клетки, на самом деле присутствуюШие в организме. Первый шаг выделения отдельных клеток — разрушение внеклеточного матрикса и межклеточных контактов, связывающих клетки.

Образец ткани обычно обрабатывают протеолитическими ферментами (например, трипсином и коллагеназой), перевариваюшими белки внеклеточного матрикса, и хелатообразуюшими агентами (такими как этилендиаминтетрауксусная кислота, или ЭДТА), которые связывают ионы Саз', опосредуюшие межклеточные контакты. Такая ткань затем может быть разрушена при помоши мягкого механического встряхивания. В некоторых методах биохимического анализа нужный белок можно в достаточном количестве получить без разделения ткани на отдельные типы клеток. Например, это справедливо для приготовления гистонов из тимуса телят, актина мышц кролика или тубулина коровьего мозга. В других случаях получение не- 8.1.

Выделение и выращивание клеток в культуре 777 обходимого белка требует его накопления в клетках определенного типа. Чтобы выделить отдельные типы клеток из смешанной суспензии, применяют несколько подходов. Наиболее распространенный способ разделения основан на мечении специфических клеток прн помощи флуоресцентного красителя, связанного с анти- телом.

Антитело подбирают таким образом, чтобы оно специфически связывалось только с поверхностью одного типа клеток ткани. Меченые клетки затем можно отделить от немеченых при помощи электронного клеточного сортера с возбуждением флуоресценции. В этом удивительном приборе отдельные клетки поодиночке проходят мимо лазерного луча, быстро измеряющего флуоресценцию каждой клетки. Вибрационный распылитель создает крошечные капельки, содержащие единственную клетку или не содержащие клеток вовсе.

Содержащие клетку капли в момент образования автоматически получают положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, обладает ли клетка флуоресценцией; затем они за счет сильного электрического поля направляются в соответствующий контейнер. редкие скопления клеток, которые обнаруживаются за счет повышенного светорассеяния их поверхности, остаются незаряженными и отправляются в контейнер отходов. Такие приборы способны эффективно выделить одну флуоресцирующую клетку из 1000 немеченых и отсортировать несколько тысяч клеток:ьа секунду (рис.

8.2). Некоторые клетки также можно получить при помощи аккуратного препарирования тонких тканевых срезов, приготовленных для микроскопического исследования (см. глава 9). В одном из подходов на кусочек ткани накладывают тонкую пластиковую пленку и облучают направленным импульсом инфракрасного лазера. Такой импульс расплавляет маленьких кружок пленки, связывая рас'положенные ниже клетки, которые затем можно отделить для дальнейшего анализа. Этот метод, называющийся лазерной захватывающей микродиссекцией, можно применять для выделения и анализа клеток из различных областей опухоли, что позволяет сравнивать их свойства и молекулярный состав со свойствами соседних нормальных клеток.

В подобном методе импульс лазера напрямую вырезает группу клеток и катапультирует их в соответствующий контейнер для дальнейшего анализа (рис. 8.3). Полученная любым из этих или каким-либо другим методом выделения однородная популяция клеток может быть напрямую использована для биохимического анализа. После разрушения клеток при помощи механического воздействия, детергентов или других процедур можно выделить цитоплазму или индивидуальные органеллы, а затем очистить специфические молекулы.

8.1.2. Клетки можно выращивать в культуре Молекулы можно выделять из целых тканей, но часто это не самый удобный источник материала, требующий, например, поездок на бойню с утра пораньше. Проблема состоит не только в удобстве. На используемом в качестве источника органов скоте невозможно проводить генетические манипуляции. Более того, сложность интактных тканей и органов является неотьемлемым недостатком при очистке отдельных молекул. Выращенные в культуре клетки представляют собой более однородную популяцию для извлечения материала, к тому же с ними гораздо удобнее работать в лаборатории. В подходящих условиях в чашке Петри большинство растительных и животных клеток может расти, делиться и даже дифференцироваться.

Клетки можно непрерывно исследовать под микроскопом или анализировать их биохимическими методами. Кроме того, на них можно систематически изучать влияние добавления или удаления специфических молекул, например гормонов 778 Часть Пуаетоды итепя маленькие группы клеток, заряженные отрицательно за счет обнаружения однои фпуоресцирующей клетки клеток, тельно я одной й клетки — 2000 коллектор кпвт колба для неоткпонившихся капель Рис. 8.2. Клеточный сортер с возбуждением флуоресценции. Измеряют флуоресценцию проходящей через лазерный луч клетки.

Капельки, содержащие единственную клетку, заряжаются положительно или отрицательно в зависимости от того, обладает ли клетка флуоресценцией. Затем они в соответствии с зарядам направляются за счет электрического поля в пробирку для сбора образцов. Отметим, что необходимо подобрать концентрацию клеток таким образом, чтобы большинство капель не содержало клеток и уходило в контейнер для отходов вместе с любыми клеточными агрегатами. или факторов роста. Более того, при смешивании двух типов клеток возможно исследовать взаимодействие одного типа с другим. Иногда эксперименты с культурами клеток называют экспериментами гл оттло (буквально — «в стекле»), в противовес раГюте с интактными живыми организмами, к которой применяют термин гп озоо (буквально -- «в живом организме»).

Эти названия иногда приводят к путанице, потому что зачастую биохимики вкладывают в них совершенно другой смысл. В биохимической лаборатории термин тл отгго относится к экспериментам, проводимым в пробирке без живых клеток, тогда как тп оттзо относится к любой реакции, протекающей внутри живой клетки, даже если эта клетка растет в культуре. ВЛ. Выделение и выращивание клеток в культуре 779 лазерный луч вырезает интересующую область тонкий срез ткани раковые клетки л предметный столик микроскопа Эр второи лазерный пуч применяется дпя «катапультирования» выбранной области в контейнер Рис. Взп Метод микродиссекции для выделения клеток из тканевык срезов. Лазерный луч использован для вырезания интересующего участка ткани и его выталкивания в контейнер. Этот подход позволяет выделить даже единичные клетки из образца ткани.

Культивирование тканей началось в 1907 г. с эксперимента, направленного на разрешение спора между нейро6иологами, чтобы проверить гипотезу, носящую название «нейронной доктрины». Ее смысл заключается в том, что каждое нервное волокно представляет собой отросток единственной нервной клетки, а не результат слияния нескольких клетгж. Чтобы проверить это утверждение, маленькие кусочки спиьгного мозга поместили в свернувшуюся тканевую жидкость и поставили в те плую влажную камеру. Через равные интервалы времени препарат наблюдали под микроскопом. Примерно через день отдельные нервные клетки начали выпускать в тромбы длинные тонкие волокна (аксоны).

Таким о6разом, нейронная доктрина получила широкую поддержку и заложила фундамент для революции в молеку. лярной биологии, произошедшей в результате разра6отки метода культивирования клеток. В этих первых экспериментах на нервных волокнах использовали маленькие фрагменты тканей, называемые эксплантатами. Сейчас культуры чаще выращивают из суспензии клеток, выделенных из тканей при помощи описанных выше методов.

В отличие от бактерий, 6ольшинство клеток ткани не спосо6но жить в толще жидкости, для роста и деления им требуется твердая поверхность. В случае клеточных кулыур такой подложкой служит поверхность плат гиковой кулыуральной чашки Петри. Однако различным типам клеток нужны различные условия, и многим клеткам для пролиферации или дифференциации необходимо наличие в чашке Петри вещества, к которому они могли 6ы прикрепиться, например полилизина или компонентов внеклеточного матрикса. Культуры, приготовленные напрямукт из клеток организма, называют пер.

ггичнььчи культпурачз. Па начальном этапе их можно фракциоиировать, то есть разделить по типам клеток, но так делают не всегда. В 6ольшинстве случаев, клетки первичной культуры можно извлекать из культуральной чашки и повтор но выращивать, получая так называемые вторичные культуры; таким образом, пх можно многократно пересевать (пассировапгь) в течение недель или месяцев. Такие клетки обладают множеством признаков, характерных для их источника (рис. 8А): фибробласты продолжают секретировать коллаген; клетки, выделенные 8.1. Выделение и выращивание клеток в культуре 781 в главе 17).

Характеристики

Список файлов книги