Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 163
Текст из файла (страница 163)
Молекулы фермента, связавшиеся в таких колонках с неподвижным субстратом, можно элюировать (извлечь из адсорбента) при помощи концентрированного раствора субстрата в свобгщной форме. Молекулы, связавшиеся с неподвижными антителами, можно элюировать путем диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированным раствором соли или раствором с высоким или низким рН. Аффинная хроматография позволяет достичь высокого уровня разделения однократным пропусканием раствора через колонку.
в) АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (обычно, на основе силикагеля), состоящие из мельчайших сфер (3 — ) О мкм в диаметре), могут быть равномерно упакованы в колонку при помощи специального прибора. Такая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяет достичь высокого уровня разрешения. В ВЭЖХ злюент (растворенное вещество) очень быстро приходит в равновесие с внутренним содержимым гранул сорбента, и, следовательно, молекулы с разным сродством к сорбенту эффективно разделяются 8.2. Очистка белков 795 даже при высоких скоростях потока.
ВЭЖХ служит основным методом очистки многих белков и малых молекул. 8.2.4. В основе аффинной хроматографии лежит использование специфических сайтов связывания белков Если начинать со сложной смеси белков, описанные выше типы колоночной хроматографии не дадут очень чистых фракций: однократное пропускание раствора через колонку обычно увеличивает долю белка в смеси не больше чем в 20 раз. Поскольку большинство отдельных белков составляют лишь 1,'1000 от общего белка клетки, для достижения достаточной степени очистки обычно приходится последовательно использовать несколько различных типов колонок (рис. 8.14). Более эффективный метод, известный как аффинная хроматография, основан на использовании биологически важных процессов связывания, происходящих на поверхности белков.
Если молекула субстрата коваленто связана с инертной матрицей, например полисахаридными гранулами, фермент, преобразующий данный субстрат, будет специфически удерживаться на сорбенте. Затем его можно элюировать (вымыть) в практически чистом виде. Точно так же можно иммобилизовать короткие олигонуклеотиды ДНК со специально разработанной последовательностью для очистки ДНК-связывающих белков, которые в норме узнают данную последовательность нуклеотидов в хромосоме (см.
рис. 7.28). В качестве альтернативы можно поместить на матрицу специфические антитела и очистить молекулы белков, узнаваемых этими антителами. В таких колонках, благодаря их высокой специфичности, при однократном пропускании смеси можно достичь увеличения доли белка в растворе в 1000 — 10000 раз. 8.2.5. Маркеры, сконструированные методами генетической инженерии, лежат в основе простого способа очистки белков При помощи описанных ниже методов рекомбинантных ДНК можно модифицировать любой ген так, чтобы его белок синтезировался со специальным маркером узнавания.
В результате, последующее очищение белка методом аффинной хроматографии будет простым и быстрым. Часто маркер сам по себе является антигенной детерминантой, или зпитопом, который может быть узнан высоко специфичным антителом. Антитело затем может быть использовано как для локализации белка в клетке, так и для его очистки (рис. 8.15). Другие типы маркеров специально конструируют для очистки белков. Например, аминокислота цистеин связывает определенные ионы металлов, включая никель и медь. Если использовать методы генной инженерии для прикрепления к концу белка короткой цепочки гистидинов, то такой слегка модифицированный белок можно селективно задержать на аффинной колонке, содержащей ионы никеля.
Таким образом, аффинную хроматографию с использованием металлов можно применять для очистки модифицированного белка из сложной смеси молекул. В качестве маркера узнавания также используют целый белок. Клетки можно модифицировать таким образом, чтобы они на одном конце интересуюшего белка синтезировали маленький фермент глутатион-Я-трансферазу (б!пга111)опе Я-Тгапз(егазе, С ЯТ).
Получившийся химерный белок может быть очищен от остальных компонентов клетки при помощи аффинной колонки, содержащей глутатион— молекулу субстрата, специфически и прочно связывающую СИТ. Если проводить 796 Часть (11. Методы в ) ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ концшпрвция соп и найосят их на следующую колонку б) ГЕЛЬ-ФИЛЬТРА)ЯИЯ о Ф о и в х Е Бномер фракциич и наносят их г) нв следующую колонку в) АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ о о к о с Х 3 л с г" в Я о номер фракции— собираем эти фракции которые на этот раз содержат высокоочищвнный белок Рис.
8.1Я. Очищение белков методом кроматографии. Типичные результаты, полученные после последовательного использования трех типов хроматографии для очистки белка. В данном примере гомогенат клеток сначала был фракционирован путем пропускания через ионообменную смолу в колонке (а). Колонку промыли для удаления всех несвязанных загрязнителей, а связанные белки элюировали путем пропускания через колонку раствора, содержащего постепенно увеличивающуюся концентрацию соли.
Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле напрямую прошли через колонку и были собраны самыми первыми. Оставшиеся белки были элюированы последовательно в зависимости от их сродства к смоле — для удаления белков с наибольшим сродством потребовалась наибольшая концентрация соли. Интересующий белок был злюирован в несколько фракций и обнаружен по его ферментативной активности. Фракции, в которых наблюдалась активность, были объединены и пропущены через вторую, гель-фильтрационную колонку (б).
Наличие в элюате все еще не очищенного белка вновь определили за счет ферментативной активности. Положительные фракции собрали и очистили до гомогенного состояния на аффинной колонке (в), содержавшей иммобилизованный субстрат фермента. г) Анализ аффинной очистки цикяин-связывающих белков из 5. сегешсбае при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, описанного ниже на рисунке 8.18. Дорожка 1 — общий экстракт клетки; дорожка 2 — белки, элюированные из эффинной колонки, содержавшей циклин 82; дорожка 3 — один основной белок, элюированный из аффинной колонки, содержавшей циклин 83.
Белки дорожек 2 и 3 элюированы из аффинной колонки при помощи соли; гель окрашен Кумасси. Шкала слева показывает молекулярный вес белков-маркеров в кДа. (г, из О. Ке))об ет а!.,1 Се)! Вю!. 13ГХ 625-685, 1995. С любезного разрешения издательства Тье Косйеуе))ег Оп)те гиту Р гем.) ген интересующего белка Рис.8.15. Маркирование зпитопом для локализации или очистки белков.
При помощи стандартных методов генной инженерии к интересующему белку может быть присоединен короткий нептидн ый маркер. Если маркер сам по себе является знтигенной детерминантой, или зпигпопом, для него легка будет найти коммерчески доступное антитело. Соответствующим образом меченое внтитело можно использовзтьдля определенияместонвхождения белка в клетке или для очистки его вффинной или основанной нв иммунной преципитзции хроматографией. В случае иммунной преципитвции в раствор, содержащий маркированный белок, добавляют направленные против зпитопного маркера антитела; антитела специфически поперечно связывают маркированные молекулы белка и осаждают их в форме комплексов знтитело-белок.
! ВСТАВКА ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ ПЕПТИДНЫЙ ЭПИТОПНЫЙ МАРКЕР ! ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТКУ маркированный питоном белок иммунопоквпизвция при помощи антител к маркеру белка быстрая очистка маркированного белка и любых связанных с ним белков очистку в условиях, ие мешающих белок белковым взаимодействиям, то химерный белок может быть изолирован вместе со взаимодействующими с иим в клетке белками (рис.
8Д6). Для дальиейшегх> улучшения методов очистки при помощи маркеров узиаваиия между нужным белком и маркером можно вставить амииокислотную последователь ность, представляющую собой сайт расщепления для высоко специфичного щютео литического фермента. Характерные для сайгон расщепления последовательности аминокислот редко случайно встречаются в белках, поэтому метку будет легко удалить без разрушения очшцеииого фермента. Такой тип специфического расщепления используют в очень эффективном методе очистки, извеспюм как тандемная аффинная очистка (Таггйеш АРДпйу Рппбсабоп 1аппгпп, 1ар.'гаддтд).
При этом один конец белка модифицируют таким образом, чтобы оц содержал два маркера узнавания, разделенных сайтом расщепления протеазой. Маркер иа самом конце химерного белка должен необратимо связываться с аффиииой колонкой, что позволяет полностью отмыть колонку от всех загрязняющих белков.
Расщепление протеаэой затем освогюждает белок, который далее очишают, используя второй маркер. Поскольку такой двухэтапиый подход дает особенно высо кую степень очистки белка при относительно небольшой затрате усилий, его широко применяют в клеточной биологии. Например, для очистки любого дрожжевого белка этим методом сконструировали набор из приблизительно б000 штаммов дрожжей, каждый со своим индивидуальным кодирующим маркер геном, пришитым к ДНК.
8.2,6. Очищенные бесилеточные системы необходимы для точного определения функций молекул Важно изучать биологические процессы независимо от сложных побочных реакций, происходящих в живой клетке с помощью очищенных бесклеточиых систем. Для этого гомогеиаты клеток фракциоиируют с целью очисттси каждой отдельной макромолекулы, необходимой для катализа интересующего биологического 8.3. Анвяиэ белков 801 Рис. 8.19. Анализ белковых проб при помощи злектрофореза в полиакриламидном геле в присутствии дСН.
На фотографии изображен окрашенный Кумасси гель, использованный для обнаружения белков на различных стадиях очистки фермента. Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную смесь белков из исходного клеточного экстракта. Каждая следующая дорожка показывает белки, полученные после хроматографического фракционирования белковой пробы, проанализированной на предыдущей дорожке (см рис 8.14). На старт над каждой дорожкой помещали одинаковое количество белка (10 мкг). Отдельные белки обычно выглядят как четкие окрашенные полосы, однако полоса может уширяться, если она содержит слишком много белка. (Нз Т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
