Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 161
Текст из файла (страница 161)
ОНИ СТАНОВЯТСЯ ГИБРИДНЫМИ КЛЕТКАМИ, КОТОРЫЕ ЗАТЕМ КЛОНИРУЮТ ".** Х лиффврвнцнроввннвя рвковвл клетка нормвльнвя клвткв мыши гвтврохврион гибридная хлвткв Рис.В.Т. Получение клеточных гибридов. Можно провести слияние двух клеток и получить гете рока рионв одну клетку с двумя ядрами. Обычно сусле из ию клеток обрабатывают определенными инвктивироввн ными вирусами или полизтиленгликолем, которые способствуют слиянию клеток путем изменения структуры их плазматической мембраны.
В конце концов, гетерокврион претерпевэет мигов, и получается гибридная клетка, в которой оболочки двух ядер разрушаются, а хромосомы объединяются в одном большом ядре. Такие гибридные клетки дают начало бессмертным гибридным клеточным линиям.
Если одна из родитель- ских клеток произошлв из опухолевой клеточной линии, то гибридную клетку называют гибридомой. иой линии из единственного секретирующего антитела В лимфоцита для получения большого количества однородных антител. В лимфоциты в норме живут в культуре ограниченное время, ио отдельные синтезирующие антитела В лимфоцитов из им муиизировапиых мышей или крыс при слиянии с клетками из трансформированной клеточной линии В лимфоцитов могут дать гибриды, способные синтезировать определсниос аититело и неограниченно размножаться в культуре. Такие гибридомы выращивают как отдельные клеточные линии, каждая из которых является постоянным источником единственного типа моиоклоиальиых антител (рггс.
8.8). Каждый их тип распознает единственный тип аитигеиного сайта, например, конкретный кластер из пяти или шести боковых цепей амииокислотных остатков на поверхности белка. За счет однородной специфичиости моиоклоиальные антитела в большинстве случаев гораздо удобнее, чем обычная иммунная сыворотка. Важное достоинство метода гибридом состоит в том, что можно сиптезировать моиоклоиальные ангитста прогна молекул, составляющих лишь малую часть сложной смеси. В обычной иммунной сыворотке, созданной для такой смеси, доля молекул антител, распознающих содержащийся в малом количестве компонент, будет недостаточной для того, чтобы принеси хоть какую нибудь пользу. Но если из В лимфоцитов, синтезирующих различные компоненты иммунной сыворотки, по лучить гибридомы, то из большого количества гибридомных клонов можно отобрать тот, который будет производить требуемое моиоклональное антитело, и выращивать зту линию для синтеза антитела в неограниченных количествах.
Таким образом, для любого белка в биологической смеси можно синтезировать мопоклоиальиое аититело. Как только аититело готово, его можно использовать для локализации, наблюдения за движением и изучения структуры и функции белка в клетках и тканях. 8,1. рьщеление и выращивание клеток В культуре. 787 мышь, иммунизированная мутантная клеточная линия, антигеном Х полученная из опухалевых Ф В-лимфоцитов клетка, синтезирующая ечз е еее анти-Х-антитела — Еее е е е В-лимфоциты (погибают (клетки растут неограниченно после нескольких дней роста долго в нормальной среде, в культуре) но погибают в селективной среде) СЛИЯНИЕ ) получившиеся клетки гибридом культивируют в планшетах со множеством лунок только клетки гибридомы вьскивают и прапифелир уют в селективнои среде оюкратироавиныа проверяют надосадочн анти-Х-антител, затем и»лунки с положительн клеткам позволяют размножаться, и отдельные надосадочные фракции тестируют на наличие анти-Х-антител клоны, даккцие положительную реакцию, яшщютсй паоимнными истачнжами вити»Х-аитител Рис.
8.8. Приготовление гибридом, секретирующих моноклональные антитела против конкретного антигена. Здесь интересующий антиген обозначен как «антиген Х». Селективная среда, используемая после зтапа слияния клеток, содержит ингибитор (аминоптерин), блокирующий нормальные биосинтетические пути образования нуклеатидов. Таким образам, клеткам приходится использовать альтернативный путь синтеза нуклеиновых кислот. Этот путь у мутантных клеточных линий, выращенных из опухолевых В-лимфоцитав, нарушен, когда каку нормальных клеток, полученных из иммунизированных мышей, он работает.
Поскольку ни адин из использованных для исходного слияния клеточных типов не способен выжить и прслифелировать сам по себе, в культуре остаются талька клетки гибридомы. ЗВКЛЮЧЕНИЕ Ткани можно диссог(пировать ни составляюи(ие их клетки, которые, в свою очередь, можно разделить по типам и очистить для биохимического анализа или создания клепгочных культур. Многие животньге и растительные клетки выжи- 788 Часть Ш. Методы вают и пролифелируют в чашке Петри при условии наличия в ней подходящеи культуральной среды, питательных веществ и соответствующих сигнальных молекул.
Несмотря на то что большинство животных клеток перестает делиться после конечного числи клеточных делений, обессмерченные при помощи спонтанных мутаций или генетических манипуляций клетки могут неограниченное время существовать в виде клеточных культур. Эмбриональньсе стволовые клетки могут неограниченно пролифелировать в культуральной чашке, сохраняя способность дифференцировиться в различные типы клеток организма. Таким образом, они обладают огромным медицинским потенциалом.
Клетки гибридомы широко используются для получения неограниченного количества однородных моноклонал ьных антител, применяемых для обнаружения и очистки клеточных белков, а также для диигностики и лечения заболеваний. 8.2. Очистка белков Задача выделения из тысяч присутствующих в клетке типов белков одного единственного является непростой, но ее необходимо решить, чтобы исследовать функцию белка гп и(гго. Ниже в этой главе мы покажем, как метод река,чбинантных ДНК значительно упрощает эту задачу, заставляя клетку синтезировать большие количества нужного белка, облегчая таким образом его выделение и очистку. Независимо от того, является ли источником белка сконструированная методами биоинженерии клетка или интактная ткань, процесс очистки обычно начинается с субклеточного фракционирования для снижения многокомпонентности материала. Затем проводят очистку белка, на каждом шаге увеличивая ее специфичность.
8.2.1. Клетки можно разделить на составляющие их фракции Чтобы очистить белок, его нужно извлечь из клетки. Клетки можно разрушить несколькими способами: их можно подвергнуть осмотическому шоку или ультржзвуковой вибрации, проташить через маленькое отверстие или измельчить в гомогенизаторе.
В результате этих процедур разрушается большинство мембран клетки (включая плазматическую мембрану и зндоплазматический ретикулум), небольшие фрагменты которых тут же заново замыкаются, образуя везикулы. Однако, при осторожном проведении процедур разрушения, такие органеллы, как ядро, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы, остаются нетронутыми. Таким образом, суспензия клеток превращается в густую кашицу (так называемый гомогенат или экстракт), содержащую различные замкнутые мембранные органеллы, каждая из которых обладает характерным размером, зарядом и плотностью.
При условии правильного подбора среды гомогенизации (путем проб и ошибок для каждой органеллы), различные компоненты, включая везикулы, получившиеся из эндоплазматического ретикулума — микросомы, сохраняют большинство своих естественных биохимических свойств. Затем необходимо разделить компоненты гомогената. Такого рода фракционирование клеток стало возможным только после коммерческой разработки в начале 1940-х гг. прибора, носящего название «препаративния ультрацентрифуга». В ней происходит высокоскоростное вращение экстракта разрушенных клеток (рис. 8.9).
Это позволяет разделить клеточные компоненты по размеру и плотности: в целом, чем крупнее частица, тем большая центрифужная сила будет на нее действовать, и тем быстрее она будет вращаться. При относительно низких скоростях седимен- 8.2. Очистка белков 789 бронированная камера седиментирующий материал охлаждение двигатель Рис. 8.9.
Препврвтивнвя ультрвцентрифуге. Проба находится в пробирке, которую помещают в цилиндрические отверстия в металлическом роторе. Зв счет быстрого вращения ротора создается огромная центробежная сила, заставляющая частицы в образце осаждаться. Вакуум уменьшает трение, препятствуя перегреву ротора и позволяя системе охлаждения поддерживать постоянную температуру образца 4 С. тируют (стседают) крупные компоненты, такис как ядра, с образованием осадка на дне центрифужной пробирки; при больших скоростях и длительном времени центрифугирования можно собрать сначала маленькие замкнутые везикулы, а за тем рибосомы (рнс.
8.зй). Все зги фракции не будут чистыми, но значительное количество загрязнителей можно удалить путем рссуснендирования осадка и по вторного проведения центрифугирования. Центрифугирование почти всегда является первым шагом фракционирования, но с его помощью можно разделить только значительно различающиеся по размеру компоненты.
Более высокого уровня разделения можно добиться путем нанесения тонкого слоя гомогената на разбавленный раствор соли, заполняютций центри фужную пробирку. Во время центрифугирования различные компоненты смеси будут двигаться через солевой раствор как отдельные полосы, каждая со своей скоростью. Этот процесс называется скоростной седиментацией (рис. о.т т, а).
Чтобы этот метод был эффективным, полосы должны быть защищены от конвек ционного смешивания, которое обычно происходит, когда более плотный раствор (например, содержшций органеллы) оказывается над менее плотным (раствором соли). В специальном приборе для смешивания раствор в пробирке усиливают слабым градиентом сахарозы. Благодаря получающемуся в результате градиенту плотности более плотный раствор будет на дне пробирки, и каждая область солевого раствора будет иметь большую плотность, чем раствор над ней, и, таким образом, конвекционное смешивание не будет мешать разделению.
При седиментации через такие разбавленные градиенты сахарозы различные клеточные компоненты будут формировать отдельные полосы, которые можно 790 ' Чвоть Ш. Методы ' гомогенат клеток ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ С НИЗКОЙ СКОРОСТЬЮ осадок содержит целые клетки ядра цитоскепет НАДОСАДОЧНУЮ ФРАКЦИЮ ПОДВЕРГАЮТ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЮ СО СРЕДНЕЙ СКОРОСТЬЮ осадок содержит митохОндрнн ЛИЗОСОМЫ вЂ” -ь ПЕРОКСИСОМЫ НАДОСАДОЧНУЮ ФРАКЦИЮ ПОДВЕРГАЮТ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЮ С ВЫСОКОЙ СКОРОСТЬЮ осадок содержит МНКРОСОМЫ гЗепьчайшие аезнху ы НАДОСАДОЧНУЮ ФРАКЦИЮ ПОДВЕРГАЮТ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЮ С ОЧЕНЬ ВЫСОКОЙ СКОРОСТЬЮ осадок содержит рибосомы вирусы крупные макромолекулы Рис. 8.10. Фракциоиирование клеток при помощи центрифугирования.
Многократное центрифугирование с постоянным увеличением скорости позволяет разделить гомагенаты клеток на компоненты. В целом, чем меньше субклеточный компонент„тем большая центробежная сила необходима для его седиментации. Типичные значения для различных шагов седиментации: низкая скоросглгк 1000 8, 10 минут средняя скорость: 20 000 8, 20 минут высокаяскоросглгн 800008, 1час очень высокая скоросглгн 150 000 8, 3 часа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
