Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 171
Текст из файла (страница 171)
Размеры вступивших в реак цгкю гибридизации молекул РНК можно определить путем сравнения со стандартам и и«звестного размера при совместном электрофорезе в экспериментальной пробе. Т ак можно обнаружить, что клетки печени мутантных мышей синтезируют нормального вэазмера мРНК альбумина в нормальном количестве; или что они синтезируют моэче»«улы мРНК нормального размера, но в сильно меньшем количестве.
Возможно та кж«е, что мутантные мРНК альбумина патологически короткие. В этом случае филытр» для блотгинга можно заново проанализировать с более короткими ДНК-зондам и, каждый из которых несет последовательность только части гена, и посмотреты, »«акая часть нормальной мРНК отсутствует. Первый метод гель -э.лектрофореза с переносом на мембранный фильтр для гибридизации — Саузе(зи-блотгинг — направлен на анализ ДНК, а не РНК. (Метод назван по фамилии изсэбретателя — Саузерна (8опйегп), а нозерн- и вестернблоттинг получили сво»«ь«азвания по аналогии; зоц(йегп по-английски означает южный, пот(йегп (позер»«) — северный, а юез(егп (вестерн) — западный.
Поскольку Саузерн-блоттинг назвалз ю честь ученого, термин пишется с большой буквы, тогда как остальные виды бгюттинга — с маленькой.) В методе Саузерн-блоттинга изолированные молекуэсы ДНК сначала расщепляют эндонуклеааами рестрикции на легко разделяемые фрагменты. Двухцепочечные фрагменты затем фракционируют гель-электрофорезом и проводят блоттинг и гибридизацию с ДНК-зондами (см. рис. 8.38). Чтобы охаршкт-еризовать структуру гена альбумина мутантной мыши, нужно использовать спеэпсфичный к альбумину ДПК-зонд и составить подробную карту рестрикции геном.а ш области гена альбумнна (она состоит из последовательностей фрагментов ДНй(, получакпцихся при обработке различными рестриктазами).
Карта позволяет олэределить, произошли ли изменения в гене альбумина в мутантных животных, нсапример, могла произойти делеция или вставка короткой последовательности ДНЕ<. Однако большинство однонуклеотидных изменений этим методом обнаружить неюо=~можно. В методе Саузерн-(5лсэттинга цепи двухцепочечных молекул ДНК на фильтре должны быть разделены .до начала процесса гибридизации; для этого ДНК после электрофореза подшер»гают воздействию щелочи, что ведет к ее денатурации (не показано). 8.4.6.
Гены можно клсэнировать при помощи библиотек ДНК Любой фрагмент Дг1Е( можно клонировать. В молекулярной биологии термин «клонирование ДНК»»ислользуют в двух смыслах. Во-первых, в прямом, то есть в отношении процесса с оз дания множества идентичных копий молекулы ДНК— амплификации определен»«ой последовательности ДНК. Во-вторых, термин также описывает выделение кюккретного участка ДНК (обычно гена) из всего объема клеточной ДНК, потому чт«э данный процесс значительно ускоряется путем создания множества одинаковых ксений интересуюшей ДНК. Как показано ранее в данной главе, термин «клонировшндэе», особенно в контексте биологии развития, также может а) нитроцвллюпозный „.Ф~~ь~р : lг У немеченая РНК или Д меченые известного размер служат маркерами агарозный.ж гель е) г) д) распсложени меченых маркеров меченые полосы 832 Часть))1.
Методы РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПО РАЗМЕРУ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ Рис. 8.38. Обнаружение специфических молекул РНК или ДНК методом гель- переноса и гибридизации. 8 данном примере ДНК-зонд регистрируют по его радиоактивности. Также широко используют ДНК-зонды, обнаруживаемые химическими или флуоресцентными методами [см. Рис. 8.34). а) Лри помощи злектрофореза разделяют по размеру либо одноцепочечные молекулы РНК (нозерн-блоглглинг), либо двукцепочечные фрагменты ДНК, получившиеся в результате обработки рестриктазами 'Гсоузерн-блоттинг). б) На гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр или пол иамидную бумагу, и разделенные РН К или ДНК переносятся на фильтр путем блоттинга. в) Нитроцеллюлозный фильтр аккуратно снимают с геля. г) Содержащий связанные нуклеи новые кислоты фильтр помещают в запечатанный полиэтиленовый пакет, наполненный соляным буферным раствором и радиоактивно мечеными ДНК-зондами. Он продолжительное время взаимодействует с ДНК-зондами в условиях, способствующих гибридизации.
д) Фильтр извлекают из пакета и промывают так, чтобы на бумаге остались только те молекулы зондов, которые гибрндизировались с иммобилизаванными РНК или ДНК. После радиоавтографии станут видны полосы ДНК, гибридизовавшейся с мечеными зондами. б) стопка фильтровальной бумаги РАЗДЕЛЕННЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ПЕРЕНОСЯТСЯ НА НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗНЫЙ ФИЛЬТР ПРИ ПОМОЩИ ТОКА БУФЕРА ЧЕРЕЗ ГЕЛЬ И ФИЛЬТР удаление нитроцеллюпозного фильтра с прочно связанными нукпеиновыми кислотами РАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫЙ ЗОНД ГИБРИДИЗУЕТСЯ С ДНК запечатанный Г полиэтиленовый меченый зонд ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ РАДИОАВТОГРАФИИ МЕЧЕНОГО ЗОНДА ПОСЛЕ ГИБРИДИЗАЦИИ С КОМПЛЕМЕНТАРНЫМИ ПОЛОСАМИ ДНК 8.4.
Анализ и манипуляции с ДНК 833 относиться к выращиванию из одной клетки болыпого числа генетически идентичных клеток или даже созданию генетически идентичных организмов. В любом случае, клонирование — это процесс создания множества генетически одинаковых копии; в данном разделе мы будем использовать термин «клонирование» (или «клонирование ДНК», или «клонирование гена») по отношению к методам, направленным на синтез большого числа идентичных копий участка нуклеиновой кислоты. Клонирование ДНК в самом общем смысле может быть произведено несколькими способами. Наиболее простой — введение определенного фрагмента ДНК в очищенный геном самореплнцирующегося генетического элемента — обычно вируса или плазмиды.
Например, фрагмент ДНК, содержащий человеческий ген, может в пробирке быть сшит с хромосомой вируса бактерий. Новую рекомбинантную молекулу ДНК затем можно ввести в бактериальную клетку, где вставленный фрагмент ДНК будет реплицироваться наравне с ДНК вируса. Всего одна такая рекомбинантная молекула ДНК, инфицировавшая единственную клетку, способна, благодаря репликационным механизмам вирусов, дать 10'з идентичных молекул вирусной ДНК меньше чем за день. Таким образом, точно во столько же раз увеличится содержание введенного фрагмента человеческой ДНК. Вирусы или плазмиды, применяемые в этом методе, называют векторами клонирования, и говорят, что размноженная путем вставки ДНК клонирована. Для изоляции конкретного гена часто начинают с создания библиотеки ДНК вЂ” исчерпывающего набора клонированных фрагментов ДНК клетки, ткани или организма.
Эта библиотека включает в себя (мы надеемся) по крайней мере один участок интересующего гена. Библиотеки можно создать при помощи вирусного или плазмидного векторов, и обычно их поддерживают в популяции бактериальных клеток. Принципы, лежащие в основе методов клонирования генов, одинаковы для обоих типов векторов клонирования, хотя детали могут изменяться.
В настояп1ее время для клонирования чаще используют плазмидные векторы. Наиболее широко используемые для клонирования генов плазмндиые векторы — маленькие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, выделенные из более крупных плазмид, встречающихся в бактериальных клетках в природе. Они обычно содержат лишь малую долю всей ДНК бактериальной клетки-хозяина, но их легко отделить от хромосомной ДНК благодаря неболыпому размеру, так как крупные молекулы при центрифугировании осаждаются в виде гранул.
Перед использованием в качестве векторов клонирования очищенные кольцевые плазмиды расщепляют рестриктазой для получения линейных молекул ДНК. Геномную ДНК, необходимую для создания библиотеки, расщепляют той же рестриктазой, и полученные фрагменты рестрикции (включая содержащие ген, который нужно клонировать) добавляют к расщепленным плазмидам. Благодаря наличию липких концов в результате отжига образуя>тся рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК, содержащие чужеродную по отношению к исходной плазмиде ДНК.
Лигаза ковалентно сшивает участки ДНК (рис. 8.39). Следукнцнй шаг создания библиотеки — введение рекомбинантных кольцевых ДНК в бактериальные клетки, которые делают временно проницаемыми для ДНК. Это процесс называется тринсфекцией. По мере того как клетки растут и делятся, увеличивая свою численность вдвое каждые 30 минут, рекомбннантные плазмиды также реплицируются.
В результате получают огромное число копий кольцевых ДНК, содержащих чужеродные гены (рис. 8.40). Многие бактериальные плазмнды несут гены устойчивости к антибиотикам (см. главу 24). Это свойство можно В.й. Анализ нманнпуляс)ин,сДН(С ВЗЕ в себя очень крупные куски ДНК (рис.
8.4(). В настоящее время для клонирования фрагментов ДНК длиной от 300 зыс. до! млн п. н, используют новый плазмидный вектор, основанный на встречающейся в Е. сой в естественных условиях г плазмиде. В отличие от меньших по размеру бактернальных плазмид, г плазмида и ее произво дная — бактериальная искусственная хромосома (Вас(ег!а! Агс!(!сга! и!гошозове, ВАС) — в клетке Е. со(г' присутствуют только в одной или двух копиях.
Возможно. тот факт, что ВАС содержится в бактериальных клетках в таком малом количестве, является причиной ее способности стабильно поддерживать крупные клонированные последовательности ДНК: при наличии всего нескольких ВАС вероятность нарушения клонированных фрагментов ДНК при рекомбинации с другими копиями плазмиды ВЕКТОР НА ОСНОВЕ ИСКУССТВЕННОЙ ХРОМОСОМЫ ДРОЖЖЕЙ Есои1 ОЧЕНЬ СЛАБОЕ НИЕ сои1 А ОГБ СЕН ~ииюиэ ° В июм левое плечо ТЕ!. ВВВВВВ правое плечо крупные фрагменты хромосом ТЕ эюэюьэкь 'ге!. б,бк10' п. н. до 10' и. н. 3,9к 10' и. н. ИСКУССТВЕННАЯ ХРОМОСОМА ДРОЖЖЕЙ, НЕСУЩАЯ ДНК.ЧЕЛОВЕКА Рис.8.41.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
