Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 175
Текст из файла (страница 175)
Отдельные пролиферирующие клетки из этой библиотеки производят большие количества единственного клонированного фрагмента ДНК. Полимераэная цепная реакция (ПЦР) позволяет напрямую клонировать ДНК термоустойчивой ДНК-полимераэой при условии того, что последовательность интересующей ДНК известна заранее. 8.5. Изучение экспрессии и функционирования генов 851 Родственные подходы используют для получения клонов ДНК, последовательность которых соответствует молекулам мРНК, за исключением того, что сначала получают ДНК-копию последовательности мРНК, называемую кДНК. В отличие от клонов геномной ДНК, в клонах кДНК отсутствуют последовательности интронов, что делает их предпочтительными клонами для анализа белковых продуктов генов. Реакции гибридизации нуклеиновых кислот являются чувствительным методом обнаружения генов или любых других интересующих нуклеотидных последовательностей. В жестких условиях гибридизации (при такой комбинации растворителя и температуры, что даже идеальная двойная спираль ДНК становится малоустойчивой), две цепи могут спариваться с образованием «гибридной» спирали только в том случае, если их последовательности почти точно комплементарны.
Огромная специфичность такой реакции гибридизации позволяет пометить любую одноцепочечную последовательность нуклеотидов радиоизотопом или химическим соединением и использовать ее в качестве зон. да для нахождения комплементарной цепи даже в клетке или клеточном экстракте, содержащих миллионы различных последовательностей ДНК и РНК.
Такого рода зонды широко применяются для обнаружения нуклеиновых кислот, соответствующих определенным генам, для ускорения их очистки и описания и определения их расположения в клетках, тканях и организмах. Нуклеотидные последовательности ДНК можно быстро и просто расшифровать при помощи высокоавтоматизированных методов, основанных на дидезокси-секвенировании ДНК. Это подход позволил определить полные последовательности ДНК геномов многих организмов.
Сравнение геномных последовательностей различных организмов позволяет отслеживать эволюционные взаимоотношения между генами и организмами, а также открывать новые гены и предсказывать их функции. Все вместе, эти методы анализа и манипуляции ДНК сделали возможными идентификацию, выделение и секвенирование генов любого интересующего организма. Соответствующие подходы позволяют ученым получать большие количества белковых продуктов этих генов, необходимые для подробного анализа их структуры и функций, а также для медицинских целей.
8.5. Изучение экспрессии и функционирования генов В конечном счете ученые хотят узнать, как гены — и кодируемые ими белки— функционируют в интактном организме. Хотя зто может показаться противоречащим здравому смыслу, но одним из наиболее показательных способов определения того, что делает ген, является наблюдение за тем, что происходит с организмом, если ген отсутствует. Изучение мутантных организмов, несущих изменения или делении в нуклеотидных последовательностях, является в биологии проверенной временем практикой и формирует основу важной области генетики.
Поскольку мутации могут нарушать клеточные процессы, мутанты часто являются ключом к пониманию функции гена. Классический генетический подход начинается с нахождения мутантов, обладающих интересным или необычным внешним видом, например, фруктовых мушек с белыми глазами или изогнутыми крыльями.
Работая в обратном направлении от фенотипа — внешнего вида или поведения особи, — можно определить генотип организма, форму гена, ответственного за зту характеристику (приложение 8.1). ганы и ~ьно~ипы 854 Часть |!!. Методы Сегодня, когда доступно множество геномных последовательностей, изучение функции гена часто начинается с последовательности ДНК. В данном случае задача состоит в переводе последовательности в функцию. Один из подходов мы описали выше в этой главе. Он состоит в поиске по базам данных подробно охарактеризованных белков, обладающих подобными продукту нового гена аминокислотными последовательностями.
Для дальнейшего исследования функции гена применяют методы, описанные в предыдущем разделе. Но для того чтобы напрямую определить функцию гена в клетке или организме, наиболее эффективным подходом является изучение мутантов, у которых этот ген отсутствует или экспрессируется его измененная версия. Понимание того, какой клеточный процесс у таких мутантов бьш нарушен, обычно проливает свет на биологическую роль гена. В данном разделе мы опишем несколько подходов к определению функции гена, начиная с последовательности ДНК или организма с интересным фенотипом.
Сперва мы рассмотрим классический генетический подход, который начинается с генетического скрининга для обнаружения интересных мутантов. За этим следует процесс идентификации гена или генов, ответственных за наблюдаемый фенотип. Затем мы опишем набор методов, в совокупности носящих название обратной генетики (еот гена к признаку»), в которой исследование для определения функции начинается с гена или последовательности гена. Этот подход часто включает в себя некоторое количество разумных предположений в области поиска гомологичных последовательностей и определения того, когда и где ген экспрессируется, а также создание мутантных организмов и описание их фенотипа. 8.5.1.
Классическая генетика начинается с нарушения клеточного процесса путем случайного мутагенеза До наступления эпохи клонирования генов, большинство генов идентифицировали по отклонениям от нормы, вызванным мутацией гена. Этот классический генетический подход — идентификация генов, ответственных за мутантные фенотипы, — проще всего реализуется в случае быстро размножающихся и легко поддающихся генетическим манипуляциям организмов, например бактерий, дрожжей, круглых червей и фруктовых мушек. Несмотря на то что спонтанные мутации иногда можно обнаружить при изучении очень больших популяций, состоящих из тысяч и десятков тысяч особей, выделение одной мутантной особи более эффективно, если направленно создавать мутации химическими веществами или радиацией, повреждающими ДНК.
Подвергая организмы действию такого рода мутагенов, можно очень быстро создать множество мутантных особей, а затем искать среди них определенный вызываюп!ий интерес дефект, как мы скоро обсудим. Альтернативой химическому или радиационному мутагенезу служит инсерчионньсй мутагенез (мутагенез методом микроинъекций). Этот метод основан на том факте, что экзогенная ДНК при случайном введении в геном может привести к возникновению мутаций, если введенный фрагмент нарушает ген или его регуляторные последовательности.
Введенная ДНК, последовательность которой известна, служит молекулярным маркером, способствующим последующей идентификации и клонированию нарушенного гена (рис. 8.53). В случае дрозофилы использование транспозона Р для инактивации генов совершило переворот в изучении функционирования генов фруктовой мушки. Мобильные генетические элементы (см. табл. 5.3, стр. 48б) также используют для создания мутаций в бактериях, дрожжах, мышах и цветковом растении арабидопсис.
85. Изучение зкспрессии и функционирования генов 855 Рис. 8.53. Инсерционный мутант львиного зева„дптйтаиигп, Мутация в единственном гене, кодирующем ре~уляторный белок, приводит к формированию лиственных побегов вместо цветков. Мутация позволяет клеткам приобрести свойства, которые больше подходят для другой части нормального растения.
Мутантное растение изобрамено слева, дикий тип — справа. (С любезного разрешения Еппсо Соеп и йозегпагу Сагрептег.) Такого рола классические генетические исследования хорошо подходят для рзз ложения по полочкам биологических процессов в экспериментальных организмах, но как можно изучать функционирование генов в человеке? В отличие от организмон, над которыми легко проводить генетические манипуляции, люди размножанттся медленно, и их нельзя умышленно подвергать действию мутагенов.
Более того, люГюй человек с серьезным дефектом какого-либо важного процесса, например репликации ЛНК, погибнет задолго до рождения. Существует два основных способа изучения человеческих генов. Во первых, поскольку гены и их функции сохранялись в течение эволюции, изучение менее сложных модельных организмов дает критическую информацию о сходных генах и процессах в человеке. Соответствующие человеческие гены можно затем изучать в культивированных человеческих клетках. Во вторых, многие не летальные му тации, например тканеспецифические дефекты лизосом или рецепторов на поверх ности клетки, возникли в человеческой популяции спонтанно. Анализ фенотипов людей г такого рода нарушениями, наравне с изучением их клеток в культуре, дал немало информации о важных функциях человеческих клеток.
Несмотря на то по такие мутации встречаются редко, их легко найти, благодаря уникальному свойству людей: мутантные индивиды привлекают к себе внимание, требуя специальную медицинскую помощь. 856 Часть 111. Методы 8.5.2. Генетический сирининг позволяет идентифицировать мутанты сО специфическими Отклонениями Как только создана коллекция мутантов модельного организма, например дрожжей или мушек, для обнаружения интересующего измененного фенотипа обычно необходимо изучить тысячи особей. Такой поиск называется генетическим скринингом, и чем больше геном, тем меньше вероятность того, что какой лиГю определенный ген будет нести мутацию. Таким образом, чем больше геном орга ниэма, тем труднее становится скрининг.
Фенотзггг, поиск которого осуществляется при помощи скрининга, может быль простым или сложным. Простые фенотипы легко обнаружить; например, можно быст)ю проверить Гюльшое число организмов на мутации, делающие невозможным выживание организма в отсутствие опреде ленной аминокислоты или питательного вещества. Более сложные фенотипы, например нарушения поведения или способности к обучению, могут потребовать более трудоемкого скрининга (рис. 8.54). Но методы генетического скрининга, применяемые даже для анализа сложных физиологических систем, должны быть как можно более простыми и, если возможно, позволять одно временное изучение большого количества мутантов. Например, разработан очень элегантный метод скрининга для поиска генов, участвующих в обработке зрительной информации у рыб данно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
