Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 173
Текст из файла (страница 173)
ПЦР-анализ с использованием ограничивающих л анус п рай мероэ дает пару полос амплифицированной ДНК для каждого человека, одна полоса представляет собой материнский вариант, а вторая — отцовский. Длина амплифицироеанной ДНК и, следовательно, положение ее полосы после злентрофореза зависит от точного числа повторов в покусе, б) В представленном здесь схематическом примере анализируются три одинаковых покуса УНТК (требующие трех различных пар специально выбранных олигонуклеотидных праймеров) трех подозреваемых (А, В и С), дающие для каждого человека. 8.4.
Анализ и манипуляции с ДНК 843 Метод ПЦР очень чувствителен; он позволяет обнаружить одну единственнук> молекулу ДНК в образце. Точно так же можно анализировать следовые количества РН К, предварительно транскрибировав их в ДНК при помощи обратной транскриптазы. Метод клонирования ПЦР в значительной мере вытеснил Саузерн-блоттинг из областей диагнгютики генетических заболеваний и низкого уровня вирусной инфекции. Также он подает большие надежды в области судебно-медицинской экспертизы, где его можно использовать для анализа мельчайших следов крови и других тканей, даже на уровне одной клетки, и идентификации человека, кому этот образец принадлежал, нри помоши его или ее генетического «отпечатка пальца» (рис.
8.4>). 8.4.10. Клетки как фабрики по производству специфических белков Основная часть из тысяч различных белков — ск>да входят и белки, выполняюшие важнейшие ключевые функции, — присутствует в клетке в очень маленьких количествах. Раньше было очень сложно, если вообще возможно, получить более нескольких микрограммов чистого белка. Возможно, наиболее важным вкладом клонирования ДНК и генной инженерии в молекулярнук> биологию стало то, что они позволили получать любой белок клетки в практически неограниченном количестве. Большие количества нужного белка получают в живых клетках при помощи векторов экспрессии (рис.
8.48). Обычно это плазмиды, созданные для получения больших количеств стабильной мРНК, которую можно эффективно транслировать в белок в претерпевших трансфекцик> клетках бактерий, дрожжей, насекомых или млекопитакмцих. Чтобы высокое содержание чужеродного белка не мешало росту клетки, вектор экспрессии часто создают таким образом, чтобы синтез чужеродной мРНК и белка начинался незадолго до того, как клетки собирают и лизируют (рис. 8.49). Поскольку нужный белок, получаемый при помощи вектора экспрессии, синтезируется внутри клетки, после лизиса клеток его необходимо очистить от белков клетки-хозяина при помоши хроматографии.
Но поскольку в клеточном лизате этого белка содержится в избытке (часто 1 — 10 от всего белка клетки), очистку легко осуществить всего за несколько шагов. Как показано выше, многие векторы экспрессии содержат молекулярный маркер — кластер гистидиновых остатков или маленький маркерный белок — в экспрессируемом белке, что облегчает очистку при помощи аффинной хроматографии (см. Рис. 8.16).
Сейчас доступны разнообразные векторы экспрессии, каждый из которых разработан для определенной клетки, в которой будет производиться белок. Таким образом, клетки можно заставить синтезировать большие количества полезных для медицины белков, например человеческого инсулина и гормона роста, интерферона и вирусных антигенов к вакцинам. В более общем случае эти методы позволяют производить в больших ко- после электрофореза в полиакриламидном геле шесть полос ДНК. Несмотря на то что некоторые люди имеют несколько общих полос, в целом картина для каждого человека индивидуальна.
Таким образом, состав покусов может служить в качестве «отпечатка пальца» для практически инва ри анти ой идентификацииции человека. Четвертая полоса 1Р1 содержит продукты той же реакции судебного образца. Исходным материалом для ПЦР может служить единственный волосок или мельчайшая капля крови, оставленные на месте преступления. При исследовании вариабельности в 5-10 раэличных локусах НМТВ вероятность того, что два случайных человека будут обладать одинаковыми генетическими характеристиками, составляет примерно 1 к 10 миллиардам. В показанном здесь случае подозреваемых Я и С можно исключить иэ дальнейшего расследования, тогда как человек, обозначенный В, остается главным подозреваемым в совершении преступления. Подобный подход широко используют для установления отцовства.
8.4. Анализ и манипуляции с ДНК 845 высокоэффективной вирусной РНК-полимерьчюй. Полученный в результате един- ственный пид РНК легко отделить от ДНК и РНК-полимеразы. 8.4.11. Белки и нуклеиновые кислоты можно синтезировать напрямую в химических реакциях Для прямого синтеза специфических последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот разработаны специальные химические реакции.
Эти методы представляют собой прямой источник биологических молекул н не требуют использования клеток или ферментов. Химический сгщтез предпочтителен для получения нуклеиновых кислот длиной до 100 нуклеотидов, что особенно полезно для опис анных выше основанных на ПЦР методов. Его также широко используют для создания специфических пептидов, которые при химическом спаринании с другими белками позволяют получать антитела против пептида. 8.4.1?. ДНК можно быстро секвенировать Методы, позволяющие быстро и легко определять нуклеотидную последовательность любого фрагмента ДНК, сделали возможной расшифровку последовательностей ДНК десятков тысяч генов и множества полных геномов (см.
табл. 1.1, стр. 27). Объем информации о последовательностях ДНК сейчас настолько велик (много десятков миллиардов нуклеотидов), что для ее хранения и анализа требуются мощные компьютеры. Секвенирование ДНК в больших объемах стало возможным после разработки в середине 70-х гг, метода дидезокси-секвенироаания ДНК, который основан на синтезе ДНК т пЫго, протекающем в присутствии терминирующих цепь дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (рис. 8.50). Несиотря на то что и в настоящее время используют тот же базовый метод, сделано много улучшений.
Секэенирование ДНК сейчас полностью автоматизировано; роботы смешивают ингредиенты, а затем загружают их, проводят синтез и считывают последовательность нуклеотидных оснонаний с геля. Терминирующие цепь нуклеотиды, помеченные флуоресцентными красителями разных цнетов, ускоряют процесс; в данном случае псе четыре реакции синтеза могут протекать в одной пробирке, а продукты могут быть разделет м э одной дорожке геля. Расположенный вблизи нижнего края геля детектор считывает и записывает цвет флуоресцентной метки на каждой полосе, по мере того как они проходят через лазерный луч (рис.
8.51). Затем компьютер считывает и сохраняет эту нуклеотидную последовательность. Некоторые современные системы полностью отказались от традиционного геля, и разделение нуклеиновых кислот в них происходит при помощи капиллярного электрофореза, метода, который еще сильнее ускоряет быструю автоматизацию. 8.4.13. Нуклеотидные последовательности используют для предсказания аминокислотных последовательностей белков Сейчас, когда секвениронание ДНК стало быстрым и надежным, оно стало предпочтительным методом косвенного определения амшюкислотных последовательностей большинства белков.
При наличии кодирующей белок нуклеотидной последовательности процесс довольно прост. Несмотря на то что в принципе существует шесть различных рамок считынания, в которых последовательность ДНК может быть транслирована в белок (по три на каждой цепи), правильную обычно ЧаСт» Ш. МОТОД»( а) двзоксирибонуклеозидтрифосфат дидвэсксврибонукпвозидтрифосфат ф ~~~эф — о— возможно удлинение цепи на 3'-конце преютствует удлинению цепи на Зкконце 5) нормальные првдцюственники (ОАТР,ОСТР,бОТРибТТР) АСС "А ( ТА ТОТСТ ТАТО ОА АА ТТСАТ ОТССА ОО СТ олигонуклеотидный праймвр редкое включение в цепь дпя ДНК-ослимвразы ~ дидвэоксирибонуклеотидв ДНК-лолимеразой блокирует ОСТАССТОСАТООАею дрльнейшийростмолекулыДНК СОАТООАСОТАССТСТОААОСО з:,/' " 5' одноцепочечная молекула дНК, гюследовательность которой необходимо определить в) юквввзввв 1 3 СОТЮАСАОТСАООТС 5 ) ДНК меченый праймвр ~ 5' 5(((((653' одноцвпочечная 3 батдтйсййтсйаатс 5' днк | +избыток Олт Р ОСТР ОСТР +ббАТР +ббПр +ООГ:ТР +ОООТР +ДНК-полимвраэа +ДНК-попимераэа +ДНК.полимераза +ДНК-полимераза ФФВ А Щ)(5 АТ $(((ЩАТОТС ф)(Е(5АТО (Е)(ДАтатся Щ)55 Атат ЯЯгтатсхатс ЯЯАТОТОАО юЩОАтатсяатсся Щ())АТОТОАат 55)(бвАтатсАатсс йз)((()(бхтатсяатссла А Т С О последгюатепьность ДНК, считываемая с геля снизу вверх, такова 6.4.
Анализ и венин)гллции с ДНК ' 647 Рис. 8.50(слева). Метод ферментативного или дидезакси-секвенирования ДНК. о) Данный метод основан на использовании дидезоксирибануклеозидтрифосфатов — производных нормальных деэоксирибонуклеозидтрифосфатов, у которых отсутствует Зьгидроксильная группа. б) Очищенную ДНК синтезируют гл итго в смеси, содержащей секвенируемые одноце почечные молекулы ДН К (серые), фермент ДНК-полимеразу, короткий праймер ДНК (оронжееыб), необходимый, чтобы ДНК-полимераза начала синтез, и четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата с(АТР, с(СТР дбТР г(ТТР: синие А, С, б и Т). Если в смеси также присутствует дидезоксирибонуклеотидный аналог («росный) одного из этих нуклеотидов, он может быть вставлен в растущую цепь ДНК.
Поскольку в этой цепи не будет ЗьОН-группы, присоединение следующего нуклеотида заблокировано и цепь ДНК в этой точке терминируется. В приведенном примере в нуклеотидную смесь было добавлено небольшое количество дидезоксиАТР (г(6АТР, обозначенный красной буквой Я). дг(АТР конкурирует с избытком нормального дезоксиАТР (г(ЯТР, голубые А), поэтому г(г(АТР иногда случайным образом включается в растущую цепь ДНК. Такая реакционная смесь, в конце концов, даст набор ДНК различной длины, комплементарных исходной секвенируемой ДНК и обрывающихся на разных А. Точные длины продуктов синтеза ДНК можно затем использовать для определения положения каждого А в расгущей цепи. в) Для определения полной последовательности фрагмента ДН К, двухцепочечную ДНК сначала разделяют на отдельные цепи, и одну из цепей используют в качестве шаблона для секвенирования.
Четыре различных терминирующих цепь дидезоксирибонуклеозидтрифосфата (гЫЯТР г(г(СТР г(дбТР сЫТТР вновь показаны красным) используют в четырех отдельных реакциях синтеза ДНК на копиях одной и той же одноцепочеч ной ДНК (серая). Каждая реакция дает набор копий ДНК, обрывающихся в различных точках последовательности. Продукты этих четырех реакций разделяют злектрофорезом на четырех параллельных дорожках полиакриламидного геля (отмечены здесь буквами А, С, б и Т). Синтезированные фрагменты обнаруживают по меткам (радиоактивным или флуоресцентным), вставленным в праймер или в один издеэоксирибонуклеозидтрифосфатов, используемых для удлинения цепи. На каждой дорожке полосы представляют собой фрагменты, терминированные на данном нуклеотиде (например, А в самой левой дорожке), но в разных положениях цепи ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
