Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 176
Текст из файла (страница 176)
В основе этого скрининга, который отслеживает ответ рыб на движение, лежит изменение поведения. Рыбы дикого типа плывут в направлении воспринятого движения, тогда как мутанты с нарушениями в системах обраГютки зрительной информации плавают в случайных направлениях — такое поведение легко вьшелить.
Одним из мутантов, обнаруженных при таком скрининге, является 1аЬ гГг, у которого отсутствует 80'т ктеток ганглия сетчатки, помогающих передавать зрительные сигналы от глаз в мозг. Поскольку клеточн гя организация сетчатки рыб данно сходна с таковой всех позвоночных, изучение таких мутантов должно способ ствовать пониманию принципов обраГютки зрительной информации у людей. 1 мм Рис. 8.94. Обнаружение поведенческого фенотипв при генетическом скрининге.
о) С е)едалз дикого типа питаются группами. Черви мигрируют, покв не встречают своик соседей, вместе с которыми они приступают к поеданию бактерий. б) Мутантные животные питаются сами по себе. (Фотографии получены Согпейв Ввгвгпапп, Сел 94: обложка, 1998. С любезного разрешения издательства Евеыег.) 85. Изучение вкспрессии и фуикциоииревания генов 857' Поскольку дефекты генов, необходимых для фундаментальных клеточных процессов, например синтеза и процессинга РНК или регуляции клеточного цикла, часто являются летальными, функции этих генов обычно исследуют на особях с условными мутациями.
Мутантные особи нормально функционируют до тех пор, пока они находятся в «пермиссивных» (от англ. регшЬэггуе — разрешающий) условиях. Но как только они подвергаются воздействию «рос гриктивных» (от англ. гезсг(ссгуе — ограничительный) условий, проявляется нарушение функционирования гена. Например, в организмах с температурочуыстыигпельными мутациями можно включать и выключать проявление нарушения, просто меняя температуру; таким образом, клетка, содержащая темперазурочувствительную мутацию в гене, необходимом для выживания, погибнет при рестриктивной температуре, но будет нормально размножаться при пермиссивной (рис. 8. 55).
Темперазурочувствительньй ген в такой особи обычно содержит точечную мутацию, вызывающую небольшое изменение его белкового продукта. мутантные клетки пропифернруют и формируют колонии при пермиссивной температуре колонии отпечатывают нв две одинаковые чашки и инкубируют при двух различных температурах мутантные клетки не могут размножаться и Формировать колонии при рестриктивной температуре обработанные мутвгенам клетки пропиферируют и образуют колонии Рис. 8.55. Скрининг не темпервтуро-чувствительных мутантов бактерий или дрожжей. Обработанные мугзгеном клетки растут при пермиссивной температуре Они делятся и образуют колонии, которые методом отпечатков переносят нз две одинаковые чашки Петри. Одну иэ этих чашек инкубируют прн пермиссивной температуре, вторую — при рестриктивной.
Клетки, содержащие темперзтурочувствительную мутацию в гене, необходимом для пролиферзции, могут делиться при нормальной, пермиссивной температуре, но не могут при рестриктивной Гв данном случае, повышенной). В бактериальных генах, кодируюших необходимые для репликации ДНК белки, найдено множество температурочувствительных мутаций. Мутанты обна ружили при скрининге подвергнутых действию мутагенов популяций бактерий на наличие клеток, которые перестают синтезировать ДНК при нагревании от 30 'С до 42 'С.
Эти мутанты впоследствии использовали для идентификации и описания соответствующих белков репликации ДНК (см. главу 5). Лналогично, скрининг на температурочувствительные мутации привел к идентификации многих белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, а также множества белков, отвечающих за движение пептидов через секреторный путь дрожжей (см. приложение 13.1). Родственные подходы скрининга позволили определить функции ферментов, принимающих участие в принципиальных метабюлических путях бактерий и дрожжей (этот вопрос рассмотрен в главе 2), а также иденти фицировать продукты генов, ответственных за правильное развитие зародышей 1)гозорйтца (см. главу 22). МЕ часть))).
Методы 8.5.3. Мутации могут привести к потере или приобретению белком функции Генные мутации разделяют на два класса: мутации «с потерей функции» и му. тации «с приобретением функции». Мутации с потерей функции приводят к тому, что продукт гена либо не работает, либо работает слишком слабо; так можно понять, какую функцию выполняет нормальный ген.
Мутации с приобретением функции приводят к тому, что продукт гена либо слишком активен, либо работает в ясира вильное время и в неправильном месте, либо работает по другому (рис. 8.56). мутация мутация с приобретением о уоповной потерей дикий тип мутация с потерей Функции Функции Функции Рис. 856. Мутации генов, порвзному влиякяцие нв белновые продукты. В данном примере белок дикого типа обладает в клетке специфической функцией, обозначенной красными лучами. Показаны мутации, которые отключают, усиливают или изменяют функцию при увеличении температуры. белок с температурочувствительной условной мутацией несет зминокислотную замену (крзснзя), которая препятствует его правильному фолдингу при 37 С, но позволяет ему нормально сворачиваться и функционировать при 25 С.
Такие условные мутации особенно полезны для исследования гкизненно необходимых генов; для изучения функционирования гена организм мог«но выращивать в пермиссивных условиях, з затем переносить в рестриктивные условия. На начальных этапах генетического анализа любой мутантной клетки или организма важно узнать, вызывает ли мугзция потерю илн приобретение функции. Стандартный тест состоит в определении того, является ли мутация доминантной или рецессивной.
Доминантная мутация вызывает формирование мутантного фено типа даже в присутствии нормальной копии гена. Рецессивная мутация не способна вьывать формирование мутантного фенотипа при наличии единственной копии гена дикого типа. Несмотря на то что были описаны случаи, когда мутация с потерей функции была доминантной, а мутация с приобретением функции — рецессивной, в большинстве случаев рецессивные мутации приводят к потере функции, а доми нантные — к приобретению. Определить, является ли мутация рецессивной или доминантной, легко. Нужно просто скрестить мутанта с диким типом и получить диплоидные клетки или организмы. Полученное потомство будет гетерозиготным по мутации.
Если мутантный фенотип в потомстве не найден, можно сделать вывод о рецессивности мутации и, скорее всего, она приведет к потере функции. 8.5.4. Тесты на комплементацию показывают, расположены ли две мутации в ОднОм гене или в равных Широкомасштабный генетический скрининг может дать мнопз разных мутаций, проявляющихся в одинаковом фенотипе. Эти дефекты могут быть расположены в различных генах, функционируюших в одном и том же п)юцессе, или могут быть разными мутациями одного гена. Альтернативные формы гена называют 85. Изучение экспрессии и функционирования генов 859 эллелями.
Наиболее распространенное различие между аллелями -- замена одной нуклеотидной пары, но различные аллели также могут нести делеции, замены или дупликации. Как тогда можно узнать, расположены ли две мутации, дающие одинаковый фенотип, в одном гене или в разных? Если мутации рецессивны, например, они приводят к потере функции определенного гена, можно провести тест на комплемеитацию, позволяющий определить, содержатся ли мутации в одном или разных генах.
Для тестирования на комплементацию в диплоидном организме гомозиготную по одной мутации особь, обладающую двумя одинаковыми аллелями мутантного гена, скрещивают с особью, гомозиготной по второй мутации. Если обе мутации расположены в одном гене, то потомство будет иметь мутантный фенотип, потому что оно не будет обладать нормальными копиями данного гена (см. приложение 8.1). Если, наоборот, мутации лежат в различных генах, то полученное потомство будет относиться к нормальному фенотипу, потому что оно будет нести одну нормальную копию (и одну мутантную) каждого гена. Таким образом мутации дополняют друг друга и восстанавливают нормальный фенотип.
Тест обнаруженных при генетическом скрининге мутантов на комплементацию показал, например, что дрожжам для переваривания сахара гачактозы требуется 5 генов, Е. со1г для формирования функционирую1цих ресничек нужно 20 генов, в сборке вирусных частиц бактериофага Т4 участвует 48 генов и сотни генов необходимы для развития из оплодотворенного яйца взрослого круглого червя.
8.5.5. Порядок работы генов в метаболическом пути можно определить при помощи эпистаза Обычно следующим шагом после идентификации набора генов, участвующих в определенном биологическом процессе, является определение порядка, в котором эти гены функционируют. Порядок генов проще всего объяснить на примере метаболических путей, где, например, фермент А необходим для синтеза субстрата для фермента В. В этом случае можно сказать, что в метаболическом пути ген, кодирующий фермент А, работает до гена, кодирующего фермент В.
Точно так же в случае, если один белок регулирует активность другого, мы скажем, что первый ген работает до второго. Порядок генов во многих случаях можно определить просто при помощи генетического анализа без каких-либо знаний о механизме действия продуктов генов. Предположим, что у нас есть биосинтетический процесс, состоящий из последовательных этапов, причем выполнение этапа В происходит только после завершения этапа А. Предположим также, что для этапа А необходим аен А, а для этапа  — ген В. Тогда нуль-мутация (мутация, отключающая функцию) в гене А остановит процесс на этапе А, вне зависимости от того, функционирует ген В или нет. С другой стороны, нуль-мутация в гене В вызовет остановку на этапе В только тогда, когда ген А все еще активен. В таком случае говорят, что ген А является эпистатическим по отношению к гену В.
Сравнение фенотипов различных комбинаций мутаций позволяет определить порядок работы генов. Такой анализ называется эпистаэом. При помощи эпистэза проанализирован путь секреции белков у дрожжей. Различные мутации в этом пути приводят к не наблюдающейся в норме аккумуляции белков в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) или аппарате Гольджи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
