Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 180
Текст из файла (страница 180)
АННЫХ МЫШЕЙ СКРЕЩИВАЮТ ОЗЕРКИ НАЛИЧИЯ ЭТОГО ГЕНА КАХ ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ ТРАНСГЕННАЯ МЫШЬ, У КОТОРОЙ ОДНА КОПИЯ ГЕНА. МИШЕНИ ЗАМЕЩЕНА В КЛЕТКАХ ЭАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ НА ИЗМЕНЕННЫЙ ГЕН Рис. В 65. Методы, используемые для замены генов в мышах. На первом этапе (а) модифицированную версию гена вводят в культивируемые ЭС клетки. Лишь в нескольких редких ЭС клетках соответствующие нормальные гены будут заменены на ген, измененный в процессе гомологичной рекомбинации. Несмотря на трудоемкость процедуры, эти редкие клетки можно идентифицировать и культивировать для получения множества потомков, каждый из которых будет нести один мутантный ген вместо одной из двух копий соответствующего нормального гена.
На следующем этапе (б) эти модифицированные ЭС клетки вводят в очень ранний мышиный эмбрион. Клетки вживляются в растущий зародыш, и некоторые соматические клетки (показаны оранжевым) полученной в результате мыши будут нести измененный ген. Некоторые из этих мышей также будут содержать клетки зародышевой линии с модифицированным геном; при скрещивании с нормальной мышью часть потомства будет нести одну копию измененного гена во всех своих клетках. Если скрестить двух таких мышей (не показано), некоторые их потомки будут содержать два модифицированных гена (по одному на каждой хромосоме) во всех своих клетках. 8.5. Изучение экспрессии и 4>ункционирования генов 873 а) б) Рис.В.бб.
Тра нсгенные мыши, зкспрессируккцие мутантную ДИК-хеликазу, преждевременно стареют. Хеликаза, кодируемая геном ХР6, участвует в транскрипции и репарации ДИК. По сравнению с мышью дикого типа того же возраста (а) у трансгенной мыши (б), зкспрессирующей дефектную версию Хрс>, проявляется множество признаков преждевременного старения, включая остеопороз, истощение, седину, бесплодие и меньшую продолжительность жизни. Использованная здесь мутация в Хр6 нарушает активность хели ха вы и имитирует мутацию, которая у людей вызывает трихотиодистрофию, заболевание, характеризующееся ломкими волосами, нарушениями развития скелета и очень маленькой продолжительностью жизни. Зги результаты указывают на то, что накопление повреждений ДИК может вносить вклад в процессы старения как у мышей, так и у людей.
(Из >. 6е Воег ет а)., 5с>елее 296: 1276-1279, 2002. С любезного разрешения издательства ААААА.) апикальиых меристем сначала побегов, а потом корней. Для многих видов таким образом можно воссоздать целое новое растение. Каллусиые культуры можно механически диссоциировать иа отдельные клетки, которые будут расти и делиться в суспеизиоииой культуре. В случае некоторых растений, включая табак, петунию, морковь, картофель и арабидопсис, единственную клетку, выделенную из суспеизиоииой культуры, можно вырастить в маленький сгусток (клон), из которого можно воссоздать целое растеиие. Клетка, из которой может быть выращена любая часть организма, называется тотипотеитиой.
Так же, как можно получить мутаитпую мышь путем генетических манипуляций ЭС клетками в культуре, создают траистеииое растение из единственной тотипотентиой растительной клетки, претерпевшей трансфекцию ДНК в культуре >рис. )(.6> ). Методы получения трансгеииых растений значительно ускорили прогресс во многих областях клеточной биологии растений. ((апример, оии сыграли важную роль в выделении рецепторов регуляторов роста и анализе механизмов морфогеиеза и экспрессии генов у растений. Также опи открыли множество возможностей в сельском хозяйстве, прииося>цих пользу как потребителям, так и производителям.
Например, стало возможным модифицировать липиды, крахмал и белки, запасаемые в семенах, для увеличения устойчивости к паразитам и вирусам, а также создавать растения, способные выживать в экстремальиых условиях, например в солончаковых болотах или иа сухой почве. Многие важные прорывы в поиимаиии развития животных сделаны в ходе изучения фрукговой мушки Оговор)>г(а и круглого червя С.
е!едапз„которь>е легко поддаются классическому генетическому анализу и экспериментальным маиипуля циям. Прогресс в биологии развития растений был в прошлом сравнительно медленным. Многие удой>иые для генетического анализа растения, такие как кукуруза и томат, обладают длинными жизиеииыми циклами и очень крупными геиомами, поэтому классический анализ и молекулярный генетический анализ тре(ювали иного времени.
В пскледиие годы все больше внимания уделяется более быстрорастушему маленькому сорняку резуховидке Таля (АгаЬ>г)орзи !Ьайапа), обладающему ие- ВИ ЧВС«Ъ))). й))ВТС«ДЫ листовые диски 24 часа инкубируют из ли а б ка с генетически модифицидованными вырезают диски бак«ярилин Адювас«е""м г '-э-:".Ф~'-"='~)~Ю'; -:.
сс« "„" каллус -' на селективной среде «««и пролиферируюттолыю и' г)Гв те клетки растения, й)6)В' т " ' '-" '" ДНК от бактерий побег эг среда для прорастания; :„"-,'.-' '-.'Ь;';.-" папанов б" '"', выращивание побега:: ... Укоренившегося всредудля " " " саженца роста корней зрелое растение, несущее трансген, который первоначально был у бактерии а) интересующий селективный транс«си маркерный ген рекомбинантная— плазмида в клетке ДдгоЬас«впигл повторы Т-ДНК длиной 26 п. н. ДНК ВЫРЕЗАЕТСЯ ИЗ ПЛАЗМИДЫ В ВИДЕ ЛИНЕЙНОЙ МОЛЕКУЛЫ И НАПРЯМУЮ ПЕРЕНОСИТСЯ В КЛЕТКУ РАСТЕНИЯ, ГДЕ ВКЛЮЧАЕТСЯ В ХРОМОСОМУ Рис.
В.бу. Процесс получения трансгенного растения, о) Краткий обзор процесса. Из листа вырезают круглый участок и инкубируют его в культуре вместе с клетками АдгоЬастеггот, несущими рекомбинантную плазмиду с селективным геном-маркером и нужным трансгеном. Поврежденные клетки на краю диска выделяют вещества, привлекающие клетки ЯдгоЬастеггеп«. Затем бактерии вводят ДНК в эти клетки.
Только те клетки растения, которые приняли соответствующую ДНК и экспрессируют селективный маркерный ген, выживут и будут пролифелировать и образовывать каллус. Манипуляция ре~уляторами роста и питательными веществами заставляет каллус формировать побеги, которые затем пускают корни и вырастают во взрослые растения, несущие трансген. 6) Приготовление рекомбинантной плазмиды и ее перенос в растительную клетку. Плазмиду ЯдгоЬасгепот, в норме несущую последовательность Т-ДНК, модифицируют, вставляя селективный маркерный ген (например, ген устойчивости к канамицину) и нужный трансген между состоящими из 25 п.
н. повторами Т-ДНК. Когда ддгоьастеггьп«узнает клетку растения, она эффективно передает цепь Днк, несущую зти последовательности, в растительную клетку при помощи специальных механизмов, которые в норме переносят последовательность Т-ДНК плазмиды. 8.5. Изучение экспрессии и функционирования генов 875 сколькими значительными достоинствами в качестве «модельного растения» (см, рис.
1.46 и 22.112). Относительно небольшой геном А. 11га1гапа стал первым полностью расшифрованным растительным геномом. Темпы исследования этого организма в настоящее время догоняют темпы исследования модельных животных. 8.5.15. Крупные собрания меченых нокаутов позволяют изучать функции каждого гена организма Для создания исчерпывающих библиотек мутаций в различных модельных организмах, включая 5. сегеп(згае, С. е!едапз, Огозор1гг(а, Ага(»Ыорзгз и мышей, необходимы совместные усилия многих лабораторий. В каждом случае конечная цель -- получение набора мутантных линий, в которых каждый ген организма систематически удаляется или изменяется так, чтобы он мог быть условно нарушенным.
Такие коллекции станут незаменимым источником информации о функционировании генов в масштабе генома. В некоторых случаях отдельные мутации в библиотеке будут экспрессировать индивидуальные молекулярные маркеры в форме уникальных последовательностей ДНК, что сделает идентификацию измененного гена простой и быстрой.
В 5. сегспгзгае задача создания полного набора из 6000 мутантов, в каждом из которых отсутствует только один ген, упрощается благодаря склонности дрожжей к гомологичной рекомбинации. Для каждого гена готовят «кассету делеции». Кассета состоит из специальной молекулы ДНК, окружающей селективный маркер и содержащей 50 нуклеотидов, последовательность которых идентична концам гена-мишени. Более того, для ускорения последующей идентификации каждой полученной мутантной линии в эту молекулу ДНК вставляют специальную последовательность- «штрих-код» (рис.
8.68). Затем в различных селективных условиях (например, ограничение по питательным веществам, перепады температуры или присутствие различных лекарств) можно вырастить большое число таких нокаутных мутангов. Выжившие клетки легко идентифицируются по своим уникальным маркерным последовательностям. С того, насколько хорошо себя чувствует каждый мутант в смеси, можно начать оценивать, какие гены являются жизненно важными, какие просто полезными, а какие необязательными для роста в различных условиях. Сложность получения информации из такого исследования мутантов дрожжей состоит в определении на основе мутантного фенотипа активности гена или его биологической роли. Некоторые дефекты — неспособность жить без гистидина, например, — напрямую указывают на функцию гена дикого типа.
Другие связи могут быть не настолько очевидными. Что может сказать внезапная чувствительность к холоду о роли определенного гена в дрожжевой клетке? Эти проблемы еще усложняются в более высокоразвитых организмах, чем дрожжи. Потеря функции единственного гена мыши, например, может повлиять на различные типы тканей на разных стадиях развития, тогда как удаление других генов может не иметь никакого видимого эффекта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
