Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 181
Текст из файла (страница 181)
Адекватное описание мутантных фенотипов мышей часто требует подробного исследования, основанного на глубоком знании анатомии, гистологии, патологии, физиологии и этологии этих животных. Однако информация, которую может дать анализ библиотек мутантов, будет полезна, Например, изучение исчерпывающей коллекции мутантов Мусор(акта депгуа1гит, организма с самым маленьким известным геномом, дало нам минимальный набор генов, необходимый для клеточной жизни. Анализ мутантов показал, что для роста в лабораторных условиях М. депгуа1гит требуется примерно три 876 Часть!П.Методы О.
х е Ф 8 ю й е Ф х Ф х 8 ЕХ д Ф «3 х с х а Б Л 3- с хо о э Е э э О. л Ю ~ 'Ф Ео о ад х с3 о х л р 0 Б А х х О." Ф ЕЬ 88 Ф Ф Ф Е х хд л Я х х ю О3 3С Х~~ Е «3 БЕ оЕ с С3 оо Яш Ф а сх '- е х х Ф л в Ф "Е х Ф Х о «3 Ф хох 888 х Х' 8 щ х в Е $ а щхл, 8ес о ейск 8ОЕ~4 ~8е о«БО ав 8 с *Е 3 Х х Е Е х вво вх$ Ф аю 2 ««ЕО х цв Ф О д х х ~ й ~~ 3= о й 3- Б л 8$ х Ф С«3Ф ох ав Э ах в - о Ф л О. Ф о о х О. д сс х х х о ст хх х о х с О 5 л О «С 8 о о х с % о 8! я а л Ю щ о х с л о,— с 'О 'о $ ь-. Х '% Ю о Х Б о х Ф Ф х ~х с х щ х о х о х х Ф Ф 3Х л Х х х о л х ОБО «3 Фв а л «3 Х3 о Ф3 с о 33 Х о о Ю х о х х х с х Е о с о Я со Л Ю с х % О.
х «С 3О о о х х ю Ф о щ х Х о О Х3 о Й 8 л о х х Ф Э О Е щ х в 3- л Ф х о Ф Х ю в ю с 3« В8 Х в о Е % Е сС о о О. х сс Х х 3- ~~ о Ф с Ф Ю Ф Ф х Лс а о о о 3« 3- х Ф х *:у с С3,- сс щ Ф Н 3« Ю «3 х с о о а о о х а 8 а с $а О о с «Э х о «С Я щ о о в 3 3 х Э Е х Е о л о х ю Ю 3" о х х Ю о О. е х д Ф Ю Ю 3" х а Ф х Ф 8 $ 3- О О О О х о а в с л Ф а о х щ о .« Г Ц3 Х о о х Е,х О 'О х о о, с '0 х х Б х Я с сл о Яя о в о о х Вх % х $ Ю х 5 о Я Ф э х о Р Е о в щ со с щ «3 8 о Б Х О. 33 Е 3Π—" о л х о Э а х э: 3« л о ю с а х 5 о С щ о в а Е щ Ф с Х ю 'х а х х х Ф х х Ф о Х Ф Б х ю л Ф Х е 8 э х я 5 Ф в о а х л 8 х х Ф Ф х х е Ф л л а' Ю х % Ю О х ю Ф Х Ф «О о о э о а а 33 в о Ф оа а с х х с 8.5.
Изучение экспрессии и функционирования генов 877 четверти его 480 кодирующих белки генов. Функции примерно 100 из этих жизненно необходимых генов неизвестны. Это говорит о том, что нам предстоит открыть еще удивительно большое количество фундаментальных клеточных механизмов, лежащих в основе жизни. 8.5.16. РНК-интерференция — это простой и быстрый способ анализа функции гена Несмотря на то что нокаут генов и изучение последствий является, возможно, наиболее эффективным методом исследования функций генов, недавно был открыт значительно более простой способ инактивации генов.
Метод РНК-интерференции (или, сокращенно, К)чА1) основан на естественном механизме, используемом многими растениями, животными, грибами и простейшими для защиты от определенных вирусов и мобильных генетических элементов (см. Рис, 7.115). В клетку или организм вводят двухцепочечную молекулу РНК (дцРНК), последовательность которой комплементарна части гена, который необходимо инактивировать.
После процессинга дцРНК, осуществляемого специальным комплексом белков, она гибридизуется с мРНК гена-мишени и приводит к ее деградации. Затем клетка исгюльзует небольшие фрагменты этой деградированной РНК для синтеза новых дцРНК, которые продолжают уничтожать мРНК гена-мишени. Поскольку эти короткие фрагменты РНК могут передаваться клеткам-потомкам, РНК1 способна вызывать наследственные изменения экспрессии генов.
Но, как мы видели в главе 7, существует второй механизм, благодаря которому РНК1 может стабильно инактивировать гены. Обраювавшиеся в цитозоле в результате деградации фрагменты РНК могут проникать в ядро и напрямую взаимодействовать с геном-мишенью, направляя его упаковку в недоступную для транскрипции форму хроматина. Такой двойной режим регуляции экспрессии генов делает РНК-интерференцию крайне эффективным инструментом отключения генов одного за другим. РНК1 часто используют для инактивации генов дрозофилы и в культурах клеточных линий млекопитающих. В самом деле, набор из 15 тысяч молекул интерферирующих РНК (по одной на каждый ген дрозофилы) позволяет исследователям за несколько месяцев проанализировать роль каждого гена мушки в любом процессе, который можно наблюдать в культуре клеток.
Скоро станет возможным проводить такой анализ с 25 тыс. мышиных и человеческих генов. РНК1 также широко используют для изучения функционирования генов нематоды С. е1едапь При работе с червями вводить дцРНК довольно просто: РНК можно напрямую впрыскивать в кишечник животного или кормить его модифицированной Е. со11, синтезирующей нужную интерферирующую РНК (рис. 8.69). РНК распределяется по всему телу червя, где она ингибирует экспрессию гена-мишени в различных типах ткани. Поскольку геном С.
е1едапз полностью расшифрован, РНК1 применяют для присваивания функций всему набору генов червя. В последнее время родственный метод стали широко применять к мышам. В данном случае для введения интерферирующих РНК не используют инъекцию или корм. Для создания трансгенных мышей, экспрессирующих интерферирующую РНК под контролем индуцируемого промотора, применянхг методы рекомбинантных ДНК. Часто это специально сконструированная РНК, способная замыкаться сама на себя и за счет спаривания нуклеотидов образовывать двухцепочечный участок, узнаваемый аппаратом.
В результате инактивируются только те гены, последовательность которых точно совпадает с последовательностью интерферирующей РНК. Часа 11).Мн ды 1 червя кормят Е. соа, вкспрессирующей двухцепочечную '. РНК еав 2 двухцепочечную РНК впрыскивают в кишечник с )8)))г> а) Рис.8.69. Создание доминантно-негативной мутации методом РНК- интерференции. о) Двух це почечная РНК (дцРНК) может быль введена в С е)едет (1) путем кормления червей Е. со)б зкспрессирующей дцРНК, или (2) путем инъекции дцРНК напрямую в кишечник, б) Эмбрион червя дикого типа вскоре после оплодотворения яйцеклетки.
П ронуклеусы яйцеклетки и сперматозоида (красные стрелки) мигрируют и сближаются в задней половине зародыша. е) Эмбрион червя на той же стадии развития, в котором ген, участвующий в делении клеток, был инактивирован КМА>. Пронуклеусы не могут мигрировать. (б и в из Р. бопсту ет а!., Л>атиге 408: 331-336, 2000.
С любезного разрешения издательства Масп>й)ап Риы>снега М.) е) 20 мкм В зависимости от типа индуцируемого промоп>ра ин>ерферирующая РНК может синтезпроваться только в определенной ткани или в конкретный момент развития, что позволяет тщательнее исследовать функции генов. Технология интерферирукяцей РНК сделала обратную генетику многих ор ганизмов простой и эффективной, но она обладает несколькими потенциальными ограничениями, отсутствующими у настоящего нокаута генов. По неизвестным причинам РНК интерференция неэффективно раГх>тает для некоторых генов. Бо лес того, в пределах целого организма некоторые ткани могут быть устойчивыми к действию ВЫА( (например, нейроны круглых червей). Другая проблема состоит в том, что многие организмы содержат большие семейства генов, члены которых обладают сходными последовательностями.
В результате, РНК> иногда инактивирует наравне с геном мишенью родственные гены. Избежать таких эффектов можно, используя Гюльшое число интерферирующих РНК, комплементарных различным участкам одного и того же гена. Результаты любого эксперимента по РНК> должны рассматриваться как серьезный аргумент в пользу функции гена, но он не является ее доказательством. 3.5Л 7.
Репортерные гены и гибридизация 1п 3)Ги показывают, где и коГда экспрессируется Ген Важную информацию о функции гена часто можно получить, исследуя, когда и где ген экспрессируется в клетке илн в целом организме. Определить временные и пространственные приш1ипы экспрессии генов можно путем замены кодирую>цей части интересующего гена репортерным геном. В большинстве случаев за зкс.
прессией гена репортера наблюдают посредством измерения флуореш(епции или ферментативной активности его белкового продукта (см. Рис. 9.2б и 9.27). Как подробно описано в главе 7, регуляторпые пг>следовательпости Д11К, рас положенные справа или слева от кодирующего участка, контролируют экспрессию $.5. Изучение экспрессии и функционирования генов 879 гена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
