Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 178
Текст из файла (страница 178)
прин ципы формирования наследственных признаков часто бывают очень сложными. Простым примером полигенного признака является цвет глаз, который определяют ферменты, управляющие синтезом и распределением пигмента меланина: чем больше синтезируется меланина, тем темнее цвет глаз. Г1оскольку в формировании меланина задействовано множество генов, цвет глаз у людей очень сильно изменяется: от бледно серого до шоколадно-коричневого. 866 Часть 111.
Методы Несмотря на то что заболевания, вызванные мутациями единственного гена (например, серповидно-клеточная анемия и гемофилия), были одними из первых открытых наследуемых фенотипов человека, лишь малая часть признаков определяется одним геном. Наиболее очевидные человеческие фенотипы — от роста, веса, цвета глаз и волос до интеллекта, темперамента, общительности и чувства юмора— являются продуктом взаимодействия многих генов. Сейчас с уверенностью можно сказать, что предрасположенн<кть к наиболее распространенным человеческим заболеваниям, таким как диабет, сердечные болезни, высокое кровяное давление, аллергии, астма и различные психические расстройства, включая серьезные депрессии и шизофрению, также определяется несколькими генами.
Исследователи ищут новые подходы, включая использование рассмотренных вылив карт гаплотипов, для понимания сложных взаимодействий между генами, работающими вместе для создания многих «чисто человеческих» признаков. 8.5.10. Обратная генетика начинает с известного гена и определяет клеточный процесс, в котором необходимо его функционирование Как показано выше, классическая генетика начинает с мутантного фенотипа (или, в случае людей, набора признаков) и. идентифицирует ответственные за него мутации (а затем и гены).
Методы рекомбинантных ДНК в сочетании с секвенированнем генома сделали возможным другой тип генетического подхода. Вместо того чтобы начинать с мутантного организма и использовать его для нахождения гена и белка, исследователь может начать с определенного гена и делать в нем мутации, создавая мутантные клетки или организмы для анализа функции гена. П<ккольку такой подход движется в обратном направлении по отношению к традиционным генетическим изысканиям, двигаясь от гена к мутациям, а не наоборот, его часто называют обратной генетикой. Обратная генетика начинает с клонированного гена, выделенного из клетки белка, обладающего интересными свойствами, или просто с геномной последовательности. Если начальной точкой служит белок, сначала идентифицируют кодирующий его ген и, если необходимо, определяют его нуклеотидную последовательн<кть.
Затем для создания мутантной версии последовательность гена можно изменить 1п гп(го. Такой сконструированный мутантный ген вместе с подходящим регуляторным участком переносят в клетку, где он может встроиться в хромосому, становясь постоянной частью генома. Все потомки модифицированной клетки будут содержать мутантный ген. Если исходной клеткой, использованной для переноса гена, была оплодотворенная яйцеклетка, то можно получить целый многоклеточный организм, содержащий мутантный ген, при условии, что мутация не является леталыюй. В некоторых из таких животных измененный ген вставляется в предшественники гамет, позволяя мутантному гену передаваться потомству.
Такой подход называется генеративной мутацией. 8.5.11. Гены можно конструировать несколькими способами Мы видели, что отсутствие определенного гена у мутантного организма может быстро указать на функцию кодируемого этим геном белка. Поэтому «нокаут» генов, при котором обе копии гена в диплоидном организме инактивируются или удаляются, является (кобенно полезным типом мутации. Однако существует еще огромное множество доступных экспериментаторам способов перестройки генов. Например, 6.5.
изучение Вксттрессии и функционирования генов 867 Рис.В.61. Эктопическвя непревильнвя экспрессия И)пт, сигналь- ного белке, влияющего нв формирование оси тела в рвнник эм- '!,",'! ~,;;~"', .з 'Ъ~".'.'-,':,';,.".,::,'-':!.-';: '.
брионвххепориз. В данном эксперименте мРНК, кодирующую:";-'!-.",, ф ф уупт, ввели в вентрзльный вегетзтивный бластомер, что привело: ".ф„'%~ ' к формированию второй оси тела (см. главу 22). (Из 5. 5о)ю! е! з!., Сед 67: 741 — 752, 1991. С любезного разрешения Евеу)ег.) комплекс нормальных белков комплекс мутентных белков комплекс мутвнтных белов и нормальных белков НЕАКТИВНЫ И АКТИВНЫМ Рис. В 62. Доминантно-негативное действие белка. Создан кодирующий мутантный белок ген, который препятствует нормальным копиям того же белка выполнять свои функции.
В приведенном простом примере нормальный белок становится активным только в составе комплекса, з мутантный белок блокирует функцию, формируя смешанный неактивный комплекс. Таким образом, единственная копия мутзнтного гена в любом месте генома способна инзктивировзть нормальные продукты других копий гена. изменяя перед вставкой гена в геном его регулятор ный участок. можно создать мутантный организм, в котором продукт гена будет синтезироваться в ано э ' мально больших количествах, в друггй ткани или в неправильный период развития (рнс, 8.61).
Помегцая ген под конт)юль индгуцируелого пролопгора, '. ВаВФ:" можно включать и выключать его в любой момент, наблюдая вызываемые этим эффекты. Индуцируемые промоторы, работающие только в определенной ткани, можно использовать для исследования влияния активации (нли инактива ции) гена только в этой ткани. Наконец, дозгинантно негативные мутации часто применяют в случае организмов, для которых введение нового измененного гена в геном проще, чем замена уже существующих. В доминантно негативном подходе используется тот факт, что большинство белков функционирует в составе больших белковых комплексов. Включение всего одного нефункционирующего компонента часто инактивирует такие комплексы. Таким образом, конструируя ген, дающий большие количества неактивного, но способного встроиться в комплекс мутантного белка, часто получают клетки, в которых комплексы не функционируют даже в при сутствии нормального белка (рис.
8.62). При обсуждении классической генетики мы отмечали, если белок необходим для выживания клетки (или организма), то доминантно негативный мутант будет нежизнеспособным. В результате функцию белка установить будет невозможно. Чтобы эта проблема не возникала в обратной генетике, можно сцепить мутантный ген с индуцируемым промотором. Это позволит синтезировать дефектный продукт 868 Часть Ш. Методы гена только «по команде >, например, в ответ на повышение температуры или в присутствии определенной сип>альной молекулы. При изучении работы гена и кодируемого им белка не всегда нужно производить серьезные изменения, такие как забивание клетки огромными количествами белка или полное удаление продукта гена.
Иногда полезно делать небольшие изменения в белковой структуре, позволяющие начать анализировать, какие части белка важны для его функционирования. Активность фермента, например, можно исследовать путем изменения единственной аминокислоты в его активном сайте. Для такой тонкой перестройки генов (и, следовательно, их белковых продуктов) необходимы специальные методы. Первым шагом часто бывает химический синтез короткой молекулы ДНК, содержащей нужный измененный участок нуклеотидной последовательности гена. Эту синтетическую олигонуклеотидную ДНК гибридизуют с одноцепочечной плазмидной ДНК, содержащей последовательность, которую необходимо изменить. Условия гибридизации позволяк>т спаривание частично комплементарных цепей ДНК.
Синтетический олигонуклеотид станет праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой. В результате получится двойная спираль ДНК, несущая в одной из цепей измененнук> последовательность. После трансфекции получают плазмиды, содержащие полностью модифицированную последовательность гена. Затем измененную ДНК вводят в вектор экспрессии, чтобы перестроенный белок синтезировать в соответствующем типе клеток и подробно исследовать еп> функцию. Такой метод изменения аминокислотных остатков в белке, носящий название сайт-иаправленного мутагеиеза, позволяет точно определить, какие участки полипептидной цепи играют ключевую роль в сворачивании белков, их взаимодействии с другими молекулами или в ферментативном катализе (рис.
8.63). 8.5.12. Модифицированные гены можно вводить в зародышевые линии многих организмов Измененные гены люжно доставить в клетки несколькими способами. ДНК можно вводить в клетки млекопитающих путем микроинъекции стеклянной микро- пипеткой или через вирус, несущий чужеродные гены. В клетки растений гены часто вводят методом бомбардировки частицами: образцы ДНК наносят на маленькие :н>лотые гранулы, которыми затем в прямом смысле выстреливают из специально модифицированного пистолета, пробивая клеточную стенку. Электропорация — это преимущественный метод введения ДНК в бактерии и некоторые другие клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
