Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 182
Текст из файла (страница 182)
Эти последовательности, точно определяющие, когда и где ген будет экспрессироваться, легко исследовать, поместив под их контроль репортерный ген и введя такие рекомбинаптные ДНК в клетку (рис. 8.70). Также можно напрямую наблюдать время и место экспрессии мРНК гена. Несмотря на то что обычно такой подход дает такую же информацию, что и ис пользование репортерного гена, бывают случаи, когда ои может предоставить дополнительные сведения; например, когда геп транскрибируется, а мРНК транс лируется не сразу, или когда конечным продуктом гена служит РНК, а не белок.
Этот метод, носящий название гибридизации ги згГи, основан на описанных выше принципах гибридизации нуклеиновых кислот. Обычно ткань мягко фиксируют, так что ее РНК сохраняется в свободной форме, способной к гибридизации с мечеными комплементарными зондами ДНК или РНК. Таким образом, можно наблюдать ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Х кпеткг а) ИСХОДНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК кодирующая последовательность белка Х нормальная посл овательность А В С 0 Е Р 2 ' регуляторные последовательности ДНК, контролирующие экспрессию гена Х рекомбинантная последовательность профиль нормальной экспрессии гена Х сайт инициации синтеза РНК косатки кодирующая последовательность Л профиль экспрессии репортерного гена у 1 2 ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ РЕПОРТЕРНОГО ГЕНА У б) ТЕСТОВЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК Г"'Г" т" 1' в) ВЫВОДЫ вЂ” регуляторная последовательность 3 в норме включает ген Х в клетке  — регуляторная последоаатепьносп 2 в норме включает ген Х в клетках О, Е и Р— регуляторная последовательность 1 в норме выключает ген Х в клетке О Рис.8.70.
Использование репортерною белка для определения пространственнопг распределения экспрессии гена. а) В данном примере кодирующая последовательность белка к заменяется кодирующей последовательностью ре портерного белка у. Картины экспрессии генов Х и у совпадают. б) Для создания тесювых молекул ДНК, кодирующих репормрный ген У, в различных комбинациях добавляют фрагменты ДНК. содержащие возможные регуляторные последовательности. Затем проверяют экспрессию этих рекомбинантных молекул ДНК после их трансфекции в различные типы клеток млекопитающих. Результаты приведены на рис. (е). 880 Часть!11. Методы а) 0,5 мм 1 мкм Рис.
8 71. Гибридизация Гл Иск для локализации РНК. а) Пространственное распределение экспрессии мРНК Оевос а раннем эмбрионе рыбки данно. этот ген кодирует лига нд а ноток-сигнальном пути (описанном а главе 15), а показанное здесь распределение отражает его роль а развитии сомитоа — будущих сегментов позвоночного столба и хвоста. 6) Локализация высокого разрешения РНК гп Пси показывает, где а ядре клетки горошка синтезируется рибосомальная РНК. Толстые тяжи диаметром 0,5-1 мкм соответствуют петлям хромосомной ДНК, содержащей кодирующие РРНК гены.
Каждое маленькое белое пятно представляет собой транскрипцию единственного гена рРНК. (С любезного разрешения Уоппгп Лапа; Ретег 5ьаш (6).) характер дифференциальной экспрессии генов в ткани и определять месторасполо жение в клетках определенных РНК (рнс. 8.7(). В эмбрионе Огоаор)гтуа, например, такой подход дал новую информат(ию о механизмах формирования различий между клетками в различных частях зародыша во время развития (см. главу 22). Используя сходные подходы, можно визуализировать определенные последователыпкти ДНК в клетке. В данном случае препараты тканей, клеток или даже хромосом па короткое время подвергают действию сильнощелочного рН для расщепления нуклеотидных пар. Затем добавляют зонды нуклеиновых кислот, позволяют им гибридизоваться с ДНК клетки и получают визуализацию (см.
риг. 8.35). В экспериментах на эукариогических клетках чаще всего использукп два репортерных белка: фермент Р галактозидазу ()5 уи1) (см. рис. 7.55, б) и зеленый флуоресцентный склок (( РР) (см. рис. 9.2б). На рис. 7.55, б приведен пример использования гена,0 уа! для наблюдения за активностью регуляторной последо вательности гена Ег е в эмбрионе Огозорlгг1а. 8.5.18. Экспрессия отдельньзк генов может быть измерена ори помов(и копицественной оопимеразной ценной р~~кц~~ с обрат~~Й транскриг(цией Несмотря на то что методы репортерных генов и гибридизации тд зтуи пока зывают, где и когда экспрессируются гены, часто бывает полезным количественно описать экспрессию, напрямую измерив уровень мРНК в клетке. Для этого можно адаптировать нозерн-блоттинг (см. Рис.
8.38), но существует более точный метод, основанный на принципе ПИР (рис. 8.72). В этом методе, носящем название ко- 882 Часть Й1. Методы ' набор специфических к генам молекул ДНК амплификацня ПЦР роботизированная «печать» на предметное стекло мРНК из образца 1, меченная красным флуорохромом мРНК из образца 2, меченная зеленым флуарохромом ГИБРИДИЗАЦИЯ ПРОМЫВКА СКАНИРОВАНИЕ КРАСНЫХ И ЗЕЛЕНЫХ СИГНАЛОВ И ОБЪЕДИНЕНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ небольшая область микрсчипа, демонстрирующая экспрессию 110 генов дрожжей Рис. 8.73.
Использование ДНК-чипов для одновременного наблюдения за экспрессией тысяч генов. Чтобы приготовить микрочип, фрагменты ДНК, каждый из которых соответствует гену, автоматически помещают на предметное стекло. Существует большое число уже готовых коммерческих микрочипов. 8 приведенном примере мРН К выделяют из двух различных клеточных образцов для прямого сравнения их относительных уровней экспрессии генов. Например, образцы можно взять из клеток, обработанных гормоном, н клеток того же типа, но нетронутых. Зги образцы переводят в кДНК и метят, один — красным флуорохромом, другой — зеленым, Меченые образцы смешивают и на микрочипе проводят реакцию гибридизации.
После инкубации чип отмывают и измеряют флуоресценцию. 8 приведенной части микрочипа, соответствующей 110 дрожжевым генам, красные пятна указывают на то, что ген в образце 1 экспрессируется сильнее, чем соответствующий ген в образце 2; зеленые пятна указывают на то, что экспрессия гена в образце 2 выше, чем в образце 1. Желтые пятна соответствуют генам, экспрессия которых в обоих образцах одинакова. Темные пятна указывают на слабую экспрессию или полное ее отсутствие в обоих образцах гена, чей фрагмент расположен в данной точке микрочипа.
(Микрочип получен 1 С Вейш ет аЦ 5сгелсе 278: 680-686, 1997. С любезного разрешения издательства ААА5.) 8.5. Изучение экспрессии и функционирования генов 883 содержат короткие олигонуклеотиды, синтезированные на поверхности стеклянной пластинки методами, подобными вытравливанию электросхем на компьютерных чипах. В любом случае известна точная последовательность и расположение каждого зонда на чипе. Таким образом, любой нуклеотидный фрагмент, вступающий на чипе в реакцию гибридизации с зондом, может быть идентифицирован как продукт конкретного гена просто по положению, в котором он связался. Чтобы использовать ДНК-чипы для наблюдения за экспрессией генов, сначала из исследуемых клеток выделяют мРНК и переводят ее в кДНК (см.
Рис. 8АЗ). Затем кДНК метят флуоресцентными зондами. Микрочип инкубируют с этим меченым образцом кДНК, чтобы прошла реакция гибридизации (см. Рис, 8.73). Затем микрочип промывают, удаляя некрепко связанную кДНК, и определяют положение на чипе связавшихся фрагментов ДНК при помощи автоматического сканирующего лазерного микроскопа. Положения на микрочипе затем соотносят с определенным геном, чей образец ДНК обнаружен в данной точке. Обычно флуоресцирующую ДНК из экспериментальных образцов (меченную, например, красным флуоресцентным красителем) смешивают с контрольным образцом фрагментов кДНК, меченных флуоресцентным красителем другого цвета (например, зеленого). Таким обраюм, если в интересующей клетке количество экспрессированной РНК от этого конкретного гена возрастает по сравнению с контрольным образцом, получившееся пятно будет красным.
И наоборот, если экспрессия гена снижается по сравнению с контрольным образцом, пятно будет зеленым. Если изменений нет, пятно будет желтым. Используя такое внутреннее сравнение, можно составлять очень точные профили экспрессии генов. На данный момент ДНК-чипы используют для изучения чего угодно: от изменения экспрессии генов, вызывающего созревание клубники, до отличительных черт экспрессии генов различных типов человеческих раковых клеток (см. рис. 7.3); или от изменений, происходящих в ходе клеточного цикла, до изменений, вызванных внезапными перепадами температур. В самом деле, поскольку микрочипы позволяют одновременно следить за болыпим количеством генов, они позволяют обнаружить тонкие изменения в клетке, изменения, которые могут никак не проявляться в ее внешнем виде или поведении.
Подробное изучение экспрессии генов также дает дополнительный слой информации, полезной для предсказания функций генов. Ранее мы обсуждали, как идентификация белков-партнеров может пролить свет на функцию данного белка. Сходный принцип работает и для генов: информация о функции гена может быть получена путем идентификации генов, обладающих такой же картиной экспрессии. Используя метод кластерного анализа, можно обнаружить наборы генов, которые регулируются скоординированно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
