Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 186
Текст из файла (страница 186)
9.4). Взаимодействие света с объектом изменяет соотношение фаз световых волн, что приводит к возникновению сложных интерференционных Часть ))); Методы ' а) Рис. 9 5. Изображения границы и точечного источника света. а) Интерференционные полосы, видимые при большом увеличении, когда свет определенной длины волны проходит мимо границы твердого объекта, находящегося между источником света и наблюдателем, б) Изображение точечного источника света. За счет дифракции мы видим сложную картину концентрических окружностей, ширина которых зависит от числовой апертуры оптической системы: чем меньше апертура, тем больше )более размыта) дифракционная картина.
Два точечных источника могут быть разрешены, только если центр первого лежит на первом темном кольце второго: так определяют предел разрешения. единственная точка через микроскоп будет видеться как размытый дигк, а два близкорасположсншях точечных объекта могут давать перекрывая>щиеся изобра жсния или сливаться в одно.
Улучи>ение качества линз не способно преодолшь это ограничение, накладываемое волновой природой света. Минимальное расстояние, на котором два объекта различимы по отдельно сти — предел разрешения, — зависит как от длины волны света, так и от числовой аг>ерг>гура> используемой системы линз. Числовая апертура ":по мера ширины входного зрачка микроскопа. масштабированная относительно расттояния до объск та; чем шире микроскоп «раскрывает свой глаз», тем «острее» он «видит» (рнс.
9.6). При наилучших условиях, с фиолетовь>л> светом (длина волны = 0,4 мкм) и чис ленной апертурой 1,4, световой микроскоп '>еоретически способен дать разреше нис около 0,2 мкм. В конце Х)Х века изготовители микроскопов достигли такого разрспи>ния, и оно редко встречается в современных, производимых на заводах микроскопах. Несмотря на то что всегда мож>го >ус>сличить изображение настолько, насколько мы этого хотим, например, проецируя его ца экран, в световой микро скоп невозможно разрешить два объекта, находящихся на расстоянии меньшем чем 0,2 мкм; они будут видны как один объект.
Обратите внимание на различие между разрешением, о котором мы говорили выше, и регистра>)ггей. Если небольшой объект, размеры которого меньше, чем предел разрешения, сам по себе испускает свет, то мы можем его ув>>деть или зарегистрировать. Таким образом, мы способпь> наблкшать единственную флуореспецтно меченую микротрубочку, хотя ее толщи на примерно в десять раз меныпе, чем предел разрешения светового микроскопа.
9.1 Нлблкшая кпетки и гветаной микпосмоп 8~~7 9.1. Наблюдая клетки в световой микроскоп 901 движение рычага 'микротомв Рис. вдо. Изготовление срезов ткани, Нз рисун- ке показано, кзк для исследования в световом микроскопе фиксированной ткани в микротоме предварительно изготавливают ее срезы. гз- обрвзеш заключенный в парафин или смолу зафиксированное стальное лезвие серия срезов нв предметном стекле окрашенных / и помещенных под покровное стекло Яффой: 9.1.5.
Определенные молекулы можно обнаружить в клетках при помогци флуоресцентной микроскопии Флуоресцентные молекулы поглощают свет одной длины волны и испускают свет большей длины волны. Если мы будем освещать такое соединение его длиной волны поглощения и смотреть на него через фильтр, пропускающий только свет испускаемой длины волны, то мы увидим светягцуюся молекулу на темном фоне.
Поскольку фон будет темным, можно обнаружить даже ничтожное количество Обычно даже после фиксации ткани остаются мягкими и хрупкими, -- серия тонких поэтому перед изготовлением срезов их срезов необходимо поместить в поддерживаю щую среду. Волыпей частью в качестве среды для заливки используют воски или смолы. В жидком состоянии эти среды проникают в фиксированную ткань и окружают ее; затем их можно сделать твердыми (путем охлаждения или полнмеризации). В результате по лучают твердый блок, из которого легко изготовить срезы на микротоме — приборе с острым лезвием, работающем как ломтерезка (рис. 9.10).
Затем срезы (толгциной 1 — 1О мкм) помешают на поверх ность приборного стекла микроскопа. В клетках (на 70'ь состоящих из воды) содержится мало компонентов, спо собных задержать прохождение световых лучей. Поэтому большинство клеток в естественном состоянии, даже после фиксации и изготовления срезов, практи чески невидимы в обычный световой микроскоп. Существует три основных под. хода к работе со срезами ткани, позволяк>щих увидеть клетки сами по себе или определенные их компоненты.
Во первых, традиционно срезы обрабатывают органическими красителями, обладающими специфическим сродством к определенным субклеточным компо нентам. Краситель гематоксилии, например, облада т сродством к отрицательно заряженным молекулам и в результате позволяет увидеть распределение в клетке ДНК, РНК и кислых белков(рис. 9.11). Однако химические принципы специфич ности многих красителей неизвестны. Во вторых, срезы тканей можно использовать для визуализации специфических профилей дифференциальной экспрессии генов.
Гибридизация тгг хЫи, которую мы обсуждали выше (разд. 8.5.17), псжазывает распределение клеток и содержание определенных молекул РНК в срезе материала или тотальном препарате малень кого организма или органа (рис. 9.12). Третий и очень чувствительный подход, повсеместно применяемый для локализации интересуклцих белков, основан на исполь:ювании флуоресцентных зондов и маркеров (см. ниже). Часть)!); Методы б) 100 мкм а) 50 мкм Рис.
9.11. Окрашивание клеточных компонентов. а) Данный срез собирательных трубочек почек окрашен двумя красителями, гематоксилином и возимом, широко используемыми в гистологии. Каыдая трубочка состоит из плотно прилегающих клеток (их ядра окрашены красным), формирующих кольцо.
Кольцо окружено внеклеточным матриксом, окрашенным фиолегпоеым. 6) Данный срез молодого корня растения обработан двумя красителями, сафранином и прочным зеленым. Прочный зеленый окрашивает целлюлозные клеточные стенки, тогда как сафранин окрашивает одревесневшие клетки ксилемы в ярко-красный. (о, из Р я. уукеатег ет а!., Гопсьопа! Н)зто)обу, 2пг) ед. 'совдеп: СЬогсш)! Оуюбиопе, 1987; б, с любезного разрешения 5теркеп бгасе.). флуоресценпюго красителя. Наблюдая обычными методами такое же число молекул пргх гого красителя, мы практически ничсто не увидим, так как молекулы будут лишь немного окрашены при прог.вечивании меченой части образца.
Флуоресцентные крас'ители, используемые для мечения клеток, можно уви деть в флуоресцентный микроскоп. Этот микроскоп похож на обычный световой, за исключением того, что свет из мощноп! источника проходит через два набора фильтров: один фильтр отрезает ненужные длины волн до того, как они достигнут образца, друго!! фильтрует свет, испускаемый обращом. Первый фильтр пропускает только те длины волн, которые возбуждают данный флуоресцентный краситель, тогда как второй блокирует этот свет и пропускает только длины волн, испускаемые при флуоресцснции образца (рис. 9.
(3). Флуоресцентную микроскопик! чаще всего применяют для обнаружения опре делснных белков или других молекул в клетках и тканях. Очень эффективный и широко распространенный метод — присоединение флуоресцентных красителей к молекулам антител, которые затем служат в качестве высокоспецифичных и уни нереальных окрашивающих реагентов, селективно связывающихся с определенными макромолекулами, которые они узнают в клетках или внеклеточном матриксе.
С этой целью широко применяют два флуоресцентных красителя. Во первых, это флуорес г(еин с ярко зеленой флуоресценцией при возбуждении синим светом. Во вторых, это родалгин, испускающий темно красный свет при возбуждении зелено желтым 9.1. Наблюдая клетки в световой микроскоп 903 Ю0 мкм Рис. 9.12.
Гибридизация РНК гп заи. В главе 8 (см. рис. 8.71) описано как при помощи гибридизации гл Ити можно визуализировать распределение различных РНК в тканях. Здесь на примере одного эмбриона плодовой мушки показан транскрипционный профиль пяти различных генов, участвующих в формировании раннего зародыша. Все зонды РНК флуоресцентно помечены различными способами (напрямую или косвенно). Результирующие изображения были ложно окрашены и совмещены так, чтобы каждый отдельный транскрипт был хорошо виден Здесь показаны профили экспрессии генов клод(езз (желтый), епдгойед (синий), збогт дозтго)алов (красный), Глтегтег)гасе пеигоЬ(озтз деуеслуе (зеленый) и тиас!е зрес(Гтс Иотеобох (фиолетовый).
(О. Коыпап ет а!., 5сгепсе 305: 846, 2004. С любезного разрешения издательства ААА5.) 3 вгораи светофильтр отрезает нежелательные флуоресцентные сигналы, пропуская специфическое зеленое излучение флуоресцеина с длиной волны 520-560 нм ИСТИНН СВЕТА 2 светоделнтсльное зеркало: отражает свет короче 510 нм, но пропускает свет длиннее 510 нм пе прон сдп линза объектива объект Рис.9.13. Оптическая система флуоресцентного микроскопа, Набор фильтров состоит из фильтров возбуждения (1), эмиссии (или запирающего фильтра) (3) и дихроичного (светоделительного) зеркала (2). Здесь показан пример набора фильтров для регистрации флуоресцентной молекулы флуоресцеина.
В данном виде микроскопии особенно важно наличие объективов с высокой числовой апертурой, поскольку при данном увеличении яркость флуоресцентного изображения пропорциональна четвертой степени числовой апертуры (см. также рис. 9.6). в) 10 мхм Рис. 9.17.
Иммунофлуоресценция. а) Микрофотография края культивированной клетки эпителия, пслученная при помощи трансмиссионного элехтронного микроскопа. Видно распределение микратрубочех и других фила ментов. б) Та же область, окрашенная флуоресцентными антителами против тубул ина, белка, из которого собираются михротрубочхи.
Изображение получено при помощи метода непрямой иммуноцитохимии (см. рис. 9.18). Красные стреляи ухазывакл на отдельные михротрубочхи, видимые нэ обоих изображениях. Обратите внимание, что за счет дифрахции в световом микроскопе толщина михротрубочех кажется равной 0,2 мхм, хотя реальный их диаметр составляет 0,025 мхм. (М. ОзЬогп, й. ууеьзтег апд К. ууеЬег, !. Сел В!о!. 77: 827-834, 1978. С любезного разрешения Тье Воске(е(!ег Утчегзяу Ргем.) частицами, например частицами коллоидного золота.
антитела применяктт для сход ных целей в злектронной микроскопии (см. ниже). При использовании антител для обнаружения и анализа определенных моле кул в клетках мы часто усиливаем сигнал флуоресценции химическими методами. Например, несмотря на то что такая маркерная молекула, как флуоресцентный краситель, может быть напрямую сшита с используемым для специфического узнавания антителом — первичны.ч антггпгеггом, — более сильный сигнал можно получить при помощи немеченого первичного антитела, которое затем взаимодей ствует со связывающим его набором меченых вторичных антител (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
