Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 189
Текст из файла (страница 189)
Благодаря таким генетически закодированным фотоактнвируемым флуоресцентным белкам отпадает необходимость введения згязда в клетку. Более того, они позволяют изучать жизненный цикл и поведение любого белка независимо от других заново синтезированных белков (рнс. 9.90). фотоактивация флуорвсцвнция в выбранной области Ос 13 мин 4 мин б) Рис. 9.30. Фотоактивация. Фотоакгивация — это вызываемый светом переход молекулы из инертного состояния в активное. В данном эксперименте фотоактивируемая форма 6ЕР экспрессирувтся в культивированной животной клетке. До активации (время О) в выбранной области (яросныб круг) при возбуждении синим светом с длиной волны 488 нм флуоресценция 0ЕР нв регистрируется совсем или ее уровень очень низок.
Однако после активации бЕР при помощи пучка света лазера с длиной волны 413 нм бГР в выбранной области начинает ярко флуоресцировать (зеленый). Можно количественно описать движение ОЕР при его диффузии из этой области. Поскольку в клетке флуоресценцией обладают только активированные молекулы, можно наблюдать эа путями миграции, оборота и деградации белков. (б, из ). цррюсоп-5спжанг апб б. Н. Рапегзоп, 5сгелсе 300: 87-91, 2003. С любезного разрешения издательства ААА5.) Третьим способом применения химерных белков с СГР является использо ванне сфокусированного пучка света лазера для тушения флуоресценции ПГР в определенной области клетки.
Анализ временной зависимости того, как оставшиеся молекулы флуоресцентного белка мигрируют в отбеленную область, позволяет получить информацию о кинетических параметрах белка. Данный метод, обычно требующий использования конфокального микроскопа, известен как восстановление флуоресценцни после фотоотбеливания (ВФПФ; Г)погезсепсе Ресоуегу а(сег Р)зо(оЫеасп)п)(, ГКАР) и, как и фотоактивация, может дать ценные количественные данные об интересующем белке, например, коэффициенты диффузии, скорости 918 Часзь(((.,(у(етоды 10 мкм фотоотбвливанив выбранная область восстановление фпуорвсценции т ~а ='а '--:е:=а необработанная б) контрольная клетка Рис. 9.31.
Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (ВИАР). Интенсивный сфокусированный свет лазера тушит, или отбеливэет, флуоресценцию бур. Путем селективного фотоотбеливания набора флуоресцентно меченых белков в заданной области клетки микроскопист может во времени наблюдать восстановление, по мере того как оставшиеся флуоресцентные молекулы мигрируют в отбеленную облаоь.
В эксперименте, показанном на (а), использовались клетки обезьяны в культуре, синтезирующие галактозилтрансферазу, фермент, который постоянно циркулирует между аппаратом Гольдин и зндоплазматическим ретикулумом. Аппарат Гольджи водной из двух клеток был фотоспбелен, а синтез нового флуоресцирующего белка был блокирован путем обработки клеток циклогексимидом. Восстановление, происходящее в результате миграции флуоресцентного фермента из ВР в Гольджи, можно наблюдать во времени.
б) Схема эксперимента, показанного на (о). (а, из !. црр!псон-5спшант ет а(., Н>нослет. Се!! В(о!. 116: 97-107, 2001. С любезного разрешения 5рппвег-уег)ав.) активногг> транспорта или скорости связывания и диссоциапии при взаимодействии с другими белками (р>тс. РпЗ(). с).1.11. Испускаю(цие свет индикаторы позволяют измерять быстро изменянициеся внутринлетОчные Концентрации НОИОв Один из способов изучения химии отдельной живой клетки — прямое введение во внутренний обьем клетки через плазматическую мемГ>рану кончика тонкого стеклянного ион селективного микроэлектрода. Этот метод используют для измерения внутриклеточной концентрации неорганических ионов, например Н', (ча', К', С( и Саз'. Однако ион селективные микроэлектроды измеряют концентрацию ионов только в одной точке клетки, и для ионов, концентрация которых мига, например Саэ+, сигнал медленный и нестабильный.
При этом такие микроэлектроды не прн. способлены для регистрации быстрых и нестационарных изменений концентрации в2О Часть й). Методы Рис. ВЗЗ. Визуализация концентрации внутриклеточного Саз' при помощи флуоресцентного индикатора. Разветвленное дерево ден>азитов клетки Пуркинье в мозжечке получает более 100 тысяч синапсов от других нейронов. Сигнал от клетки передается вдоль единственного аксона, выходящего из тела клетки внизу рисунка. это изображение внутриклеточной концентрации Са" в отдельной клетке Пуркинье )из мозга морской свинки) получено при помощи высокочуествительной камеры и Са>'-селективного флуоресцентного индикатора гога-2.
Концентрация свободного Са>' показана разными цветами: красный соответствует максимальной концентрации, синий — минимальной. Наибольший уровень Са>' обнаружен в тысячах ветвей дендритов. )С любезного разрешения О. УУ. Таях, >. Я. Соппог, М. Боб>глоп) и а. Я. бйпаз.) аккуратно измерить концентрацию свободного Га"'. Такого ро>1а индикаторы используют д.ш посскундного наблюдения за изменением копне>п рации внутриклеточного Саз" в различных частях клетки в флуоресцентном микроскопе (рис. 9.33). Сходные 4>луоресцентнь>с индикаторы применяют для измерения других ионов; некоторые, наприл>ер, реагируют на Н' и, следовательно, позволяют определить рН.
! 1скоторые из этих индикаторов могут проникать в клетку посредством диффузии, н поэтому нх нс надо вводить мпкроннъекцией; это позволяет одновременно наблю дать во флуоресцентный микроскоп болыпс>е количество отдельных клеток. Новые типы индикаторов, используемые в сочетании с современными методами обработки изображений, привели к возникновению быстрых и точных методов ана:шза изменений концентрации множества различных малых молекул в клетке.
9Л Л 2. Доступно несколько методов введеннл в клетку везцеств, длл которь>х мембрана непроннцаема Часто бывает полсшо ввести в живук> клетку молекулы, для которых мсм брана непроницаема. Это могут быль антитела, узнающие внутриклеточные белки, нормальные белки клетки, меченные флуорссцентщям маркером, или молекулы, влияющие на функционирование клетки.
Один из подходов .. это микроинъекция молекул в клетку при помо>ци стеклянной микропипетки. После мнкроинъекции в клетку антитела могут блокировать функцию молекулы, с которой они взаимодействуя>т. Например, анти миозин П антитела нри введении в оплодотворенную яйцсклетку морского ежа не позволяют ей делиться надвое, несмотря на то что деление ядра протекает нормально. Это наблюдение говорит о том, что миозин 11 играет ключевую роль в процессах сокращения, разделяющих цитоплазму во время деления клетки, но не требуется для деления ядра. Микроинъекция, хотя и широко используется, требует введения микропипетки в каждую клетку по отдельности. Следовательно, одновременно удается изучать всего несколько сотен клеток. Другие подходы позволяют одновременно делать проницаемыми мембраны больших популяций клеток. Например, частичное нарушение плазматической мембраны клеток делает ее более проницаемои; для этого обычно используют моп1ный удар электрического тока или химические соединения, например слабые растворы дстсргснтов.
Достоинство электрического подхода состоит в том, 9.1. Наблюдая клетки в световой микроскоп 921 что он позволяет создавать в плазматической мембране (х>льшие поры, не повреждая при этом внутриклеточные мембраны. В зависимосги от типа клетки и силы тока поры позволяют проникать в клетку (и покидать ее) даже макромолекулам.
Такой процесс электропорации также ценен для молекулярной генетики в качестве метода введения молекул ДНК в клетки. При ограниченном использовании большинство клеток восстанавливает свою плазматическую мембрану и выживает. Третьим методом введения крупных молекул в клетки является слияние замкнутых мембранных везикул, содержащих эти молекулы, с плазматической мембраной.
Таким образом, их «груз» попадает в клетки. Этот метод широко используют для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, например, ДНК для изучения трансфекции или РНК для экспериментов с РНК> (описанных в главе 8). В области медицины данный подход применяют для направленной доставки новых лекарственных соединений.
Наконец, ДНК и РНК можно нанести на мельчайшие золотые частицы и выстрелить ими в клетку с болыпой скоростью. Живые клетки, поглотившие этн покрытые нуклеиновыми кислотами золотые частицы (их диаметр обычно меньше 1 мкм), способны эффективно встраивать введенную РНК (используемую для изучения временной экспрессии нли РНК>, например) или ДНК (для стабильной трансфекции). Все четыре метода, представленные на рис.
9.34, широко используют в клеточной биологии. 9.1.13. Свет можно использовать не только для визуализации микроскопических объектов, но и для манипуляции ими Фотоны об>ладают небольшим импульсом. Это означает, что объект, который поглощает или отражает луч света, испытывает действие небольшой силы. В случае обычных источников света такое давление излучения слишком мало, чтобы его стоило учитывать.
Но оно важно в космическом масштабе (препятствуя гравитационному коллапсу звезд) и, в некоторой степени, в биологической лаборатории, где интенсивный луч лазера способен давать достаточную силу для передвижения маленьких объектов внутри клетки. Если луч лазера направлен на объект, чей показатель преломления выше чем у окружения, луч отражается и очень большое число фотонов меняет свое направление. Ход отражения фотонов заставляет объект оставаться в фокусе луча; если он начинает смещаться от своего положения, давление излучения возвращает его обратно, сильнее действуя на одну его сторону. Таким образом, управляя сфокусированным лучом лазера, обычно инфракрасного, потому что он меньше всего поглощается компонентами клетки, можно создать «оптический пинцет» для передвижения субклеточных объектов, например органелл и хромосом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
