Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 191
Текст из файла (страница 191)
Сейчас сущесгпвуют методы обнаружения, измерения и слежения за гграк тически любой нужнои молекулой в живой клетке. Флуоресцентные индика торные красители позволяют измерять концентрации определенных ионов в опгдельных клегпках или в разных частях клеток.
Флуоресцентные белкгг представляют собой особенно удобные зонды, которые можно присоединить к другим белкам при помощи генетических манипуляггий. Пракгггически любав интересующий белок можно экспрессировагпь в форме флуоресцентного хи мерного белка и визуализировать его в клетке при помогци флуоресцентнои микроскопии. Динамическое поведение и взаимодеггствггя многих соег)инениг), часто на уровне единственной молекулы, можно наблюдать в живых клетках, используя различные флуоресцентные белковые метки. Радиоактивные изопюпы также можно при.менять для биохимического и микроскоггического наблюдения за судьбой определенных молекул. Световая микроскопия ограничена в разрешении.
Микроскопы, в которых используют другие типы излучения, — в особенности электронные микроскопы — спо собны разрешать гораздо меньшие структуры, чем световые микроскопы. За Гюльшее разрешение приходится платить; процесс приготовления препаратов для электронной микроскопии значительно сложнее Более того, трудно сказать, насколько соответствует то, что мы видим на изображении, реальной исследуемой структуре. Однако сейчас стало доступным очень быстрое замораживание для сохранения структур для электронной ыикрггскоггии. Цифровой анализ изображений можно использовать для восстановления трехмерных объектов, объединяя информацию о множестве отдельных частиц или изображения единственнопг объекта, полученные под разными углами.
92. Изучение клеток монекуп в электронный агикроскоп,933 Некоторые замороженные образцы можно исследовать напрямую в электронном микрг>скопе, используя специальный охлажденный держатель для препаратов. В других глучаях замороженный блок можно разбить для выявления внутренних поверхнг>стей или окружающий лед можно испарить для разоблачения внешней поверхности. Однако зачастую мы хотим исследовать тонкие срезы и с>красить их для дг>стижения адекватной контрастности изображения электронного микроскопа (смотри ниже). Таким образом, в качестве компромисса ткань быстро замораживают, замещают воду, поддерживаемую в стекловидном состоянии, органическими раство рителями и заключают ткань в пластмассу на основе смолы. Затем изготавливают срезы и проводят окрашивание.
Несмотря на то что с технической точки зрения этот процесс все еп1е трудоемок и непрост, он позволяет стабилизировать и сохранить тка>п в виде, очень близком к ее исходному живому состоянию (рис. 9.45). клеточная стенка аппарат Гопьджи митохондрия рибосомы 100 нм Рис.в.аб. Тонкий срез клетки. Данный тонкий срез принадлежит очень быстро замороженной дрожжевой клетке, в которой стекловидный лед был замен>ен сначала органическим растворителем, а затем пластмассой на основе смолы. Хорошо видны ядро, митохондрии, клеточная стенка, аппарат Гольджи и рибосомы в состоянии, которое можно считать настолько приближенным к живой клетке, насколько зто возможно. (С любезного разрешения Апг>ген> бтаепебп.) Контрастность электронного микроскопа зависит от атомного номера атомов г>бразца: чем выше атомный номер, тем бг>льше рассеивается электр>>нов и тем выше контрастность, Биологические ткани состоят из атомов с очень маленькими атомными номерами (в основном, углерода, кислорода, азота и водорода).
Для того чтобы сделать их видимыми, их обычно пропитывают (до или после изготов ления срезов) солями тяжелых металлов, например урана илн свинца. Уровень пропитки, или «окрашивания», этими солями позволяет увидеть с разной степенью контрастности различные клеточные компоненты. Жирь> после фиксации осмием, например, темноокрашены, что позволяет определить расположение клеточных мембран. 934 Часть Ш. (э(етолы 9.2.3. Определенные макромолекулы можно локализовать при помощи иммунной электронной микроскопии кОллОиднОГО золота Мы видели, как для локализации определенных макромолекул антитела можно использовать в сочетании с флуоресцентной микроскопией. Лналогичный метод— иммунная электронная микроскопия коллоидного золота — можно применить в электронном микроскопе. Обычно тонкий срез инкубируют с определенным первичным антителом, а затем со вторичным антителом, к которому прикрепле на частица коллоидного золота.
Золотая частица является электронно плотной, и в электронном микроскопе она выглядит как черная точка (рнс. 9А6). Тонкие срезы в ТЕМ часто не способны передать трехмерную организацию клеточных компонентов и могут направить исследователей по ложному пути. Ли нейная структура, например микротрубочка, может на срезе выглядеть точечным объектом, а срез через выступающие части единого сплошного тела неправильной 4юрмьг может заставить его выглядеть как два отдельных объекта.
Третье измерение зрсгвр зрспор Спгпбтр Зрстгр Рис.9.46. Локализация белков в электронном микроскопе. Здесь иммунную электронную микроскопию коллоидного золота используют для локализации четырех различных белковых компонентов полюса веретена деления дрожжевой клетки. На верхней микрофотографии изображен тонкий срез дрожжевого мигогич еского веретена деления.
Микрогрубочки пересекают ядро и соединяются с полюсами веретена деления, погруженными в ядерную оболочку. Схема компонентов полюса веретена деления показана ниже. Использованы антитела против четырех различных белков полюса веретена деления в сочетании с частицами коллоидного золота (черные гпочки), указывающими на то, где в сложной структуре расположен каждый белок. (С любезного разрешения 3оьп К~!гласной 92. Изучение клеток молекул в электронный микроскол 93У ектронная шка линза конденсора шкательная о линза обьектива электроны от образца образец Рис.9.49.
Сканирующий электронный микроскоп Образец сканируют пучком электронов, фокусирующимся на препарате электромагнитными катушками, исполняющими роль линз Детектор измеряет количество рассеянных или испущенных электронов при последовательной бомбардировке каждой точки поверхности образца и контролирует интенсивность точек на изображении, формирующемся на видеоэкране. 5ЕМ позволяет получать удивительные изображения трехмерных обьектов с большой глубиной фокуса и разрешением от 3 нм до 20 нм в зависимости от прибора. (Фотография приведена с любезного разрешения Апдгеш Оаиез ) части)((г)У(етоДЭЯ в) 1 мкм 5 мкм а) Рис.9.50.
Сканирующав электронная микроскопия. о) Полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа микрофотография стереоцилии, выпупающей из волосковой клетки внутреннего уха лягушки-быка. б) Дифференциальная интерференционная контрастная световая микроскопия и (в) трансмиссионная электронная микроскопия тонкого среза. (С любезного разрешения агспагб!асоьз и 3агпез нцдзреть.) ТОЗО 50 нм Рис. 9.51. Ядерная пора. Быстрозамороженные ядерные оболочки визуализированы при помощи 5ЕМ высокого разрешения, снабженного в качестве источника электронов автозлектронной эмиссионной пушкой. Данные изображения обеих сторон поры показывают предел разрешения микроскопа, и их нужно сравнивать с рис.
12.9. (С любезного разрешения Магон боЫЬегв и Теггу Абел.) Некоторые обработанные таким образом препараты достаточно тонки или малы для того, чтобы электроны напрямую в них проникали. Это справедливо для отдельных молекул, макромолекулярных комплексов и вирусов, которые до наны ления металла можно высушить на плоской поддерживающей пленке, изготовленной из отнггсительно прозрачного для электронов материала, например, углерода или 9.2. Йзучение клеок молелул в злектронный микроскоп, 939 Рис. 9.52. Приготовление металлической реплини поверх- ности образца. Обратите внимание, что толщина металла от- ражает контур поверхности исходного образца. образец пластика.
Также при помощи напыления металла можно визуализировать внутреннюю структуру клеток. В атом случае образцы быстро замораживают (как описано выше) и расщепляют лезвием ножа. Содержание льда в разрушенной поверх. ности уменьшают путем испарения льда в вакуум при повышении температуры — этот процесс носит название лиофилизации (замораживания высушивания). На части клетки, экспонированные в этом процессе травления, напыляют металл для создания металлической копии. Оставшийся органический материал клетки должен быть растворен, для того чтобы осталась лишь тонкая металлическая реплика поверхности образца. За тем ее укрепляют углеродной пленкой, помещают на сетку и исследуют в трансмиссионном электронном микроскопе (рис.
9.52). Данный метод по зволяет визуализировать структуру внутреннего содержания клетки и ее трехмерную организацию с удивительной четкостью (рис. 9.53). твкепый металл, испаренный с нити накаливания, «оттеняетз образец сверху напыляется упрочняющая пленка углерода реплику переносят на поверхность сильного растворителя дпя ликвидации образца 9.2.6, Негативное Окрацгиаание реплику промывают н помещают и криоэлектронная микрОскОлия на медную сетку для изучения лозаолякгт Видеть макромолекулы с ВысОким разрешением 'е)~ . 5 Ййвх«к чйааайгааа Несмотря на то что и.юлированные макромо лекулы, например ДНК и крупные белки, можно визуализировать в электронном микроскопе путем напыления тяжелого металла для создания контрастности, более тонкую структуру можно увидеть, используя негативное окрашивание.
По этому методу молекулы, нанесенные на тонкую углеродную пленку, смешивают с раствором соли тяжелого металла, например уранилацетата. После того как образец высыхает, очень тонкий слой соли металла покрывает углеродную пленку, за исключением областей, где расположена адсорбированная макромолекула. Поскольку электроны проходят через макромолекулы значительно лучше, чем через окружающую соль тяжелого металла, создается обратное негативное изображение молекулы. Негативное окрашивание особенно эффективно для визуализации макромолекулярных агрегатов, например вирусов и рибосом. и субъединичной структуры белковых филаментов (рис. 9.54). Напыление металла и негативное окрашивание пгхзволяют получить изображения маленьких макромолекулярных ансамблей в высоком разрешении, но предел разрешения обоих методов ограничивает размер самой маленькой металлической частицы в окрашивании или напылении.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
