Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 192
Текст из файла (страница 192)
Недавно разработанные альтернативные подходы позволяют напрямую визуализировать в высоком разрешении даже вну- 940 Часть 1й. Методы 0,1 мзм Рис. 9.53. Регулярное расположение белковых филаментов в мышце насекомого. Для получения данного изображения мышечные клетки быстро заморозили до температуры жидкого гелия, расщепили по цитоплазме и подвергли глубокому травлению. Затем была изготовлена и исследована при большом увеличении металлическая реплика.
(С любезного разрешения Набег Сопке и зппп Нешег.) треннее содержимое таких трехмерных структур, как вирусы и органеллы. В данном методе, носяп1ем название криовлектронной микроскопии, ключевым моментом опя гь является быстрое замораживание для создания стекловидного льда. На микроскопической сетке приготавливают очень тонкукт (около 100 нм) пленку водной суспензии вируса или очищенного макромолекулярного комплекса. Ватам образец быстро охлаждают путем поме1цення его в хладоагент. Для поддерживания такого водного препарата при температуре — 1б0 'С в вакууме микроскопа используют спе циальный держатель, в котором образец можно наблюдать напрямую без фиксации, окрашивания или высушивания. В отличие от негативного окрашивания, в котором мы видим окрашив,шие вокруг исключеннопг обра,ща, водная криозлектронная 100 нм Рис.
9.54. Негативно окрашенные антиповые филаменты. На данной микрофотографии, полученной при помощи трансмиссионной электронной микроскопии, каждый филамент имеет толщину около В нм и при ближайшем рассмотрении состоит из спиральной цепи глобулярных молекул актина. (С любезного разрешения йоаег Сга19.] 9.2. Изучение кпеток молекул в электронный микроскоп 941 микроскопия создает изображение макромолекулярной структуры самой по себе. Однако для извлечения максимально возможного объема информации о структуре необходимо использование специальных методов обработки изображения, которые мы опишем ниже.
9.2.7. Для увеличения разрешения можно объединять несколько изображений Любое изображение, полученное электронным или световым микроскопом, составлено из частиц — электронов или фотонов, — попадающих в некоторый детектор. Но эти частицы подчиняются законам квантовой механики, поэтому число достигших детектора частиц можно предсказать только статистически. При предельно большом числе частиц распределение в детекторе достаточно точно определяется визуализируемым образцом. Однако при меньшем количестве частиц исходная структура на изображении зашумляется флуктуациями числа регистрируемых частиц на каждом участке образца.
Термин «шу и» описывает случайные отклонения, ухудшающие реальное изображение образца. Шум играет большую роль в световой микроскопии при маленькой интенсивности освещения, но в электронной микроскопии он создает серьезные сложности при работе с неокрашенными макромолекулами. Молекула белка, не повреждаясь, выдерживает только несколько десятков электронов на квадратный нанометр, и эта доза на несколько порядков ниже, чем необходимо для получения изображения в атомном разрешении.
Решение состоит в получении изображений множества одинаковых молекул— до десятков тысяч отдельных микрофотографий — и объединении их для создания усредненного изображения, на котором будут видны детали структуры, скрытые шумом на исходных изображениях, Этот метод называется одиочастичной реконструкцией изображений. Однако до объединения отдельных изображений их необходимо совместить друг с другом. Иногда можно заставить белки и комплексы образовать кристаллическую структуру, в которой каждая молекула расположена в определенной ориентации в узлах регулярной решетки.
В данном случае проблема совмещения легко решается, и ~ акой тип электронной кристаллографии позволил расшифровать несколько структур белков в атомном разрешении. Однако, в принципе, нет строгой необходимости в кристаллических решетках. Г1ри помощи компьютера можно обработать и объединить цифровые изображения случайно распределенных и по-разному ориентированных молекул для получения реконструкций высокого разрешения. Несмотря на то что структуры, обладающие некоторой внутренней симметрией, упрощают процесс совмещения и делают его более точным, этот метод применяют и для структур, лишенных симметрии, например рибосом.
На рис. 9.55 показана структура икосаэдрического вируса, расшифрованная с высоким разрешением при помощи сочетания множества частиц и совмещения изображений. В случае регулярных кристаллических решеток электронная микроскопия достигает разрешения 0,3 нм. Этого достаточно для того, чтобы наблюдать внутреннее атомное строение белков. Более того, разрешение в данном случае может соперничать с рентгеноструктурным анализом.
Предел разрешения одночастичной реконструкции изображений сейчас составляет около 0,5 нм, достаточно для идентмфнкации субьединиц и доменов белков и, частично, вторичной структуры белка. Несмотря на то что электронная микроскопия вряд ли заменит рентгеноструктурный анализ (см. главу 8) в качестве метода определения структуры макромолекул, она обладаст несколькими очевидными преимуществами.
Во-первых, ей далеко не всегда а) 100 нм 1О нм (100 А) Рис. 9.$5. Одночастичнвя реконструкция изобрвншния. Сферические белковые оболочки вируса гепатита В сохраняются в тонкой пленке льда (а) и визуализируются в трансмиссионном злектронном микроскопе. Тысячи отдельных частиц объединены при помощи одночастичной реконструкции для получения трехмерной карты икосаздрической частицы, показанной на (б). Отдельный белковый димер (в), формирующий выступы нв поверхности вируса, в двух ориентациях показывает, что разрешения (0,74 нм) достаточно для расшифровки упаковки полипептидной цепи (с любезного разрешения В.
Во1- сспег, 5. А. уууп не и й. А. Сгоияпег (а); В. Вонспег, 5. А. уууппе и й. А. сгоильег, ягагаге 388: 88-91, 1997 (б и в) и издательства Мвспзаап Риыиб- 2 нм (20А) егз(Ш.) в) требуются кристаллические образцы. Во вторых, она способна визуализировать очень большие комплексы — структуры, которые могут быть слишком крупными нли изменчивыми для получения удовлетворительных кристаллов. Анализ крупных и сложных макромолекулярных структур упрощается, если известна, например, из рентгеноструктурного анализа, атомная структура одной или нескольких субъединиц комплекса. Молекулярные модели тогда могут быть математически «вписаны» в оболочку структуры, определенной в менынем раз решении при помощи электронного микроскопа.
На рис. 9.56 показана структура рибосомы и определенное данным методом положение связанного с ней фактора освобождения (см. также рис. 6.?4 и 6.75). 9.2. Изучение клеток молекула электронный микроскоп 943 а) Рис.9.56. Одночастичая реконструкция изображения и подбор молекулярной модели.
Бактериальные рибосомы, содержащие освобождающий фактор„необходимый для высвобождения белка из рибосомы, и без него, использованы для получения трехмерных крио-ЭМ карт с разрешением, превышающим т нм. Почти 20 тысяч иэображений отдельных рибосом, сохраненных во льду, использовали для получения одночасгичной реконструкции. На (а) 305-субьединицу (желглая) и 505-субьединицу рибосомы (синяя) можно отличить от дополнительной электронной плотности, соответсшующей фактору терминации ВЕ2 (розовый), Затем известную молекулярную структуру КГ2 вписали методами молекулярного моделирования в эту электронную плотность.
(из и. В. 5. кажет ет а1., лгагиге 42п 87-90, 2003. с любезного разрешения Масгпб!ап Роылнегз Цд.) 9.2.8. Различные ракурсы одного объекта можно объединить длл получения трехмерной реконструкции Детекторы, применяемые для записи изображений электронных микроскопов, дают двумерные изображения. Благодаря большой глубине поля микроскопа все части трехмерного образца находятся в фокусе, и конечное изображение представляет собой проекцию структуры вдоль направления наблюдения. Потерянную информацию в третьем измерении можно восстановить, если у нас есть изображения этого же образца в различных ракурсах.
Вычислительные алгоритмы для данного метода разработаны в 60 х г ., и их широко используют в медицинской компьютерной томографии (КТ). В КТ устройство получения изображений движется вокруг пациента для получения различных ракурсов В электронной (клеточной) томографии держатель образца в микроскопе наклоняется, что позволяет дгк.-гичь такого же результата. Таким образом, мы можем получить трехмерную реконструкцию в выбранной стандартной ориентации путем объединения набора различных ракурсов одного обьекта в поле зрения микроскопа. Каждое отдельное изображение будет сильно зашумлено, но их совмещение и усреднение в трех пространственных измерениях значительно снижает уровень шума, давая четкое изображение молекулярной структуры. Начиная с толстых срезов заключенного в пластмассу материала, трехмерные реконструкции, или томогриммы, широко используют для подробного описания анатомии маленьких областей клетки, например аппарата Гольджи (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
