Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 188
Текст из файла (страница 188)
9.24). Интенсивный сайт специфический мутагепеэ последовательности исходного гена привел к по лучению пол~зной флуоресценции в разнообразных организмах — от животных и растений до грибов и микробов. Также улучшена эффективность флуоресценции и созданы альтернативные формы белка, отличающиеся по спектрам поглощения и испускания в сине зелено желтых пределах.
Недавно открытое в кораллах 9.1. Наблюдая клетки в световой микроскоп 91 3 Рис. 9.24. Зеленый флуоресцентный белок [6РР). На схематически изображенной здесь структуре 6ЕР хорошо видны одиннадцать Р листов, образующих стенки «бочки». Внутри» бочки» расположен активный хромофор 1глемно-зеленый), который формируется постгрансляционно из выступающих боковых цепей трех аминокислотных остатков. (Адаптировано из М.
Оггпо е! а!., 5с>енсе 273: 1392-1395, 1996. С любезного разрешения издательства ААА5.) родственное семейство флуоресцентных белков позволило использовать красную область спектра (смотри рис. 9.14). Одно из самых простых применений ОГР является его использование в качестве репортерной молекулы — флуоресцентного зонда для наблюдения экспрессии генов. Можно создать трансгенный организм, у которого С ГР кодирующая последова.
тельпость будет находиться подтранскрипционным контролем промотора интересующего гена. Это позволяет напрямук> наблюдать профиль зкспрес сии генов в живом организме (рис. 9.25). Другое применение — присоединение к О>ГР сигнального пептида для направления его в определенный комнартме>п ктетки, например, зндоплазматическнй ретикулум или митохондрию. В результате органелла освещается, и можно наблюдать ее в жи>юм состоянии (см.
рис. 12.35, б). Кодирукицук> последовательность Д))К ОГР также можно вставить в начало или конец гена другого белка, что приводит к син тезу химерного продукта, сг>стоящего из этого белка и присоединенного к нему ОГР домена. Во многих случаях такой химерный белок с ОГР ведет себя так же, как и исходный белок, напрямую указывая на его положение и функционирование, благодаря генетически Рис. 9.25.
Использование зеленого флуоресцентного белка (6ЕР) в качестве репортера. В данном эксперименте, проводившемся на фруктовой мушке, ген 6ЕР присоединяли (методом рекомбинантных ДНК) к мушиному промотору, активному только в определенном наборе нейронов. Данное изображение живого эмбриона мушки было получено при помощи флуоресцентного микроскопа. На фотографии видны примерно 20 нейронов, из каждого выходят длинные отростки (аксоны и дендриты), сообщающиеся с другими (нефлуоресцирующими) клетками.
Эти нейроны расположены прямо под поверхностью животного и позволяют ему чувствовать его ближайшее окружение. (уу. В. 6гоеьег е! а!., Сигг. Вю!. 13: 618-626, 2003. С любезного разрешения Еиеиег.) 9.1. Набя я'клетки в световой мик оскоп 915 нща Р 9.1.10. Динамику белков можно наблюдать в живых клетках В настоящее время флуоресцентные белки используют не только для локали. зации определенного белка в клетке, но и для изучения его кинетических свойств и взаимодействия с другими белками.
Здесь мы опишем три метода, в которых С~ГР и родственные ему белки используют для этих целей. Первый метод — зто наблюдение за взаимодействием одного белка с другим при помощи резонансного переноса энергии флуоресценции (Г!погезсепсе Кезо пансе Епегй>у Тгапз(ег, ГКЕТ). В данном подходе, принцип которого описан выше (см.
рис. 8.2б), две интересук>щие молекулы метят разными флуорохромами, по добранными таким образом, чтобь! спектр испускания одного из них перекрывался со спектром поглглцсния другон>. Если два белка связываются друг с другом и их флуорохромы сближаются на расстояние меньше 5 нм, один флуорохром переносит энергию поглощенного света на другой. Таким образом, когда комплекс освещают светом длины волны возбуждения первого флуорохрома, регистрируемая флуо ресценция будет иметь длину волны испускания второго флуорохрома. В данном методе в качестве флуорох(юмов можно использовать две различные спектральные формы СЕР и наблк>дать такие процессы, как взаимодействие сигнальных молекул с рецепторами или белков в макромолекулярных комплексах (рпс.
9.28). Высокая организация и быстрота многих внутриклсточных процессов, наири мер действия сипильных молекул или движения белков цитоскелета, усложняют их изучение на уровне единственной клетки. В идеале мы хотим вводить в живу>о клетку любую интересук>щую молекулу в точно заданный момент времени н в точ но заданном положении и следить за гюследующим поведением и ответом клетки Рис.
9.28. Резонансный перенос энергии флуоресценции (ЕЯЕТ). Данный эксперимент показывает, что белок 5)а1р может плотно взаимодействовать с белком АЬр1р, участвующим в присоединении кортикального ангина к поверхности клеток почкующихся дрожжей, 5(а1р экспрессируется в дрожжевой клетке (а) в качестве химерного белка с желтым производным 0ЕР (УЕ Р). АЬр1р экспрессируется в качестве химерного белка (б) с голубой формой 0 ЕР (СЕР). Сигнал РВЕТ (см.
также рис. 8 26), показанный здесь красным (в), получается путем возбуждения СЕР, но регистрации флуоресценции УЕР, которая будет испускаться, только если два белка находятся близко друг к другу (на расстоянии меньше 0,5 нм). Накортексе (г) после объединения (а), (б) и (в) видны три типа пятен: пятна одиночного 5)а1р (сгпрелки на а), пятна одиночного АЬр1р (стрелка на б) и пятна дающего сигнал РВЕТ комплекса этих белков, ложноокрашенное и скорректированное изображение которого показано на (д). Поскольку уже известно, что 5)а1р участвует в формировании клеточных включений, данный эксперимент физически связал этот процесс с процессом присоединения ангина к клеточному кортексу. (Из П. Т ууаггеп ет а!., 1 СеУ 5с!.
115: 1703-1715, 2002. С любезного разрешения Тье Согпрапу о( В>о(об!515.) в) 9)б ' ' Часть!И. Методы на зту молекулу. Микроинъекции не гггхзволяктт точно контролировать место и время доставки молекулы. Более аффективный подход - синтез неактивной формы интересуюгцей флуоресцентной молекулы, введение се в клетку и внезапная акти вация в выбранном клеточном сайте путем фокусирования на нем луча света.
Этот процесс называют фотоактивацией. Такого рода неактивные светочувствительные молекулярные предшественники, часто называемые ° .запертыми» молекулами, сконструированы для многих флуорохромов. Для фокусировки интенсивного пучка света лазера на мельчайшей области клетки можно использовать микроскоп, так что экспериментатор способен контролировать, где и когда будет фотоактивирована флуоресцентная молекула. Один из классов «запертых» флуоресцентных белков получают нутелг нрн соединения фотоактивируемого флуоресцентного маркера к очищенному белку. Важно, чтобы модифицированный белок оставался биолопгчсски активным: меченис «запертым» флуоресцентным красителем добавляет на гтоверхнгкть белка объемную группу, которая легко может изменить свойства бслка. Удовлетворительный протокол мсчення обычгкг составляется путем проб и ошибок. Как только биологически актив ный меченый белок синтезирован, его необходимо ввести в клетку (см. рис.
9.34), где можно наблюдать за его поведением. 11апример, меченный «запертым» флуорес ценном тубулин при введении в делящуюся клетку может встраиваться в микротру бочки митотического веретена деления. Когда небольшой участок веретена деления осиещактг ла.г:ром, меченый тубулин начинает флуоресцировать, что нозволяе! с легкостью следить за его движением вдоль мггк1хгг1тубоггек 1рис. 9.29). в) в) г) 10 мкм Рис. 9 29. Визуализация движения микротрубочек в митотическом веретене деления при помощи «запертого» флуоресцеина, связанного с тубулином. а) В метафазное веретено деления, образовавшееся )л и!го в экстракте икринок Хелороз, включены три флуоресцентных маркера: меченный родамином тубулин (красный) для маркирования всех микротрубочек, синий ДНК-связывающий краситель для мечения хромосом и меченный «запертым» флуоресцеином тубулин, который также встраивается во все микротрубочки, но его не видно, потому что он не флуоресцируетдо активации ультрафиолетовым светом.
б) Луч УФ-света локально активирует меченный «запертым» флуоресцеи ком тубули н слева от метафа зной пластинки. В течение следующих нескольких минут (на в — через 1,5 минуты, на г — через 2,5 минуты) сигнал «запертого» флуоресцеи на-тубули на мигрирует к левому полюсу веретена деления. Это указывает на то, что тубулин постоянно движется, хотя веретено деления (видимое благодаря красной флуорес цен цяя меченного родамином тубули на) остается большей частью неизменным. (Из К. Е. 5аеип а ос( Т !. Влгтсш »оп, !. Се!l Вю!.
112: 941-954, 1991. С любезного разрешения Тие Носье(ейег Опмегз!ту Рге»я) 9Л. Наблюдая клетки в световой микроскоп - 91 7 Метод фотоактивации усовершенствован после открытия того факта, что гены, кодируюгцие ПГР и родс~венные флуоресцентные белки, могут быть мутнрованы (обычно заменой единственной аминокислоты) для синтеза белковых форм, которые в нормальных условиях возбуждения флуоресцируют слабо, но которые можно за ставить интенсивно флуоресцировать путем активации их ярким лучом свеса отличной длины волны. По существу, микроскопист затем может зл с пю следить за локаль ным поведением любого бгшка, который может быть зкспрессирован как химерный белок с одной из таких форм СГР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
