Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 190
Текст из файла (страница 190)
Данный метод, который иногда называют лазерным пинцетом, применяют для измерения сил, налагаемых отдельными актинмиозиновыми молекулами, отдельными мнкротрубочками и РНК-полимеразой (рис. 9.35). Интенсивные направленные лазерные лучи, которые хорошо поглощаются биологическими объектами, можно использовать для менее изящных манипуляций в качестве оптических скальпелей для убийства отдельных клеток, прожигания или вырезания в них дырок или для отделения одного внутриклеточного компонента от другого. Таким образом, оптические приборы могут служить базовыми инструментами для клеточной микрохирургии.
Х хо э хс сйххао о ОХФХ х ад~с ~Ф о Ф ОФХХФ~ ООсФХХ х -ххх ООХБ $Вхсиой Ф ОООО О'4 Ф О~ зл~ .ю- О~Х Фа у х Бз 2 Х*Х вЂ” Фдохх-Ф одсхох х~%~~ сох $ хасххх схх ~~ о с~у,~ О ~у ф ма с С ФХ Х Х ФС Ф с ЕЯ Б сод~ Ф Ь м х Ф х х Ф Х Ф О до Ф ХФ Р лй 'х Ф ~ ф Охи Ф Ф Ф ~д о Ф о х дх ~~ * ь Х Ф Ф с" вод ФЭ-Ц с с > 3 с о с ас Ф О Ф Ф хсх хо о Ф с - о ФОФХ~Ф ХОФХО Ф а Х х Ф вхФФ Ф й — ао'"х а Х $ Р Фхсхо ФФХДСО ФО Фас с Ф Х ХФФЦФ Ф Ф~$8Р Й,х ы Ф З х с Ф а Ф Х .-ЯИо х х Ф ~ и а $*,-1~ ~ Ф В О х Ф ФО,х Ф о ао о Ф Ф О х С Ф СОН ФФ ~Ф х . о Фсх Ф с Ф х о Ф о о Ф Фх х х х хо~.о ДФ>.х Ф О ~ ~ ~Ф о. с Ф 9.1 гнаблв)(аяшзепсн В озепш(зй йккроскол 923 Зос Ос 3 мин 1 мин Рис. 9.35.
Оптический пинцет. Сфокусированный луч лазера можно использовать для захвата микроскопических частиц и целенаправленного их передвижения. В данном эксперименте такой оптический пинцет используется для захвата маленькой кремниевой тра пулы (О 2 им, сгпрелко), покрытой несколькими молекулами кинезина (О с), и переноса ее на изолированный мерцательный аксонемный комплекс, состоящий из ми кротрубочек (30 с).
Видимое на рисунке яркое свечение — это отражение лазера от поверхности раздела между водой и покровным стеклом. Кинезин на высвобожденной грануле (1 мин) сопрягает гидролиз АТР с движением вдоль микротрубочек, и снабжает энергией транспорт гранулы вдоль аксонемного комплекса (3 мин).
(Из 5. М. В(оса ет а)., Э(отиге 348: 348-352, 1990, С любезного разрешения Маспхйап Роыьаегз 'стг(.) 9Л.14. Отдельные молекулы можно визуализировать при помощи флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения Граггулы можно использовать для слежения за движением белков, но предпо чтительнее иметь возможность визуализировапг белки сами по себе. В принципе, этого можно досп~чь путем мечения белка флуоресцентным маркером, лиГю химически присоединяя маленькую флуоресцентную молекулу к изоли!юванному белку, либо экспрессируя флуоресцентную химерную конструкцикт (см. разд.
9.1,9). Однако в обычных микроскопах невозможно надежно регистрировать отдельные флуоресцентные молекулы. Это ограничение не связано с пределом разрешения, оно вытекает из интерференции света, испускаемого находяп(имися не в фокусе молекулами. В результате флуоресценция интересующей молекулы затемняется. Эта проблема решается при помощи специального оптического метода, носящего на звание микроскопии флуоресценции полного внутреннего отражения (Тоса! !п1егпа! Кейес(апсе г!погезсепсе, Т!Кг).
В микроскопе луч лазера светит на поверхность покровного стекла точно под критическим углом полного отражения (рис. 9.36, а). Благодаря полному внутреннему отражению свет не проникает в образец, и поэтому большинство флуоресцентных молекул не освещается. Однако электромагнитная энергия распространяется в форме затухающего поля на очень короткгге расстояние под поверхность покровного стекла и, соответственно, в образец. В результате воз буждаются только те молекулы, которые лежат ближе всего к покровному стеклу.
Когда эти молекулы флуоресцируют, испускаемый ими свет уже не конкурирует со светом нижележащих молекул, и, следовательно, его можно зарегистрировать. Метод Т!КГ позволил провести несколько эффектных экспериментов, например, визуализацию единственного моторного белка, движущегося вдоль микротрубочки, или формирования и ветвления единственного антипового филамента. На данный момент метод ограничен тонким слоем вблизи поверхности клетки толщиной около 100-200 нм (рис.
9.36, 6 и в). о Сс о о о Ф «1 1 8 8 Но 'ение о о х х о д о С3 о )Г~ е х х о а е о х д е 30 Ю о х "' о х х щ Л е х О П3 й и е — с О с х ед х с О О. 1.ф е О с Ф с х х ч л $' в." ~Ь р х а Х а ф о Ф х д х сх 36 а н. о с х П О о $ х х о д с х е о о Ф с о $ о х с $ н зь о р х $ р а а я о ~ ~о «П л а СП «3 О« Е х д Я Х Сх о а х х щ ~ 30 а о с о П х х х о а х а Ф О Х О. н Х н а а е с $ о '.5 Зх х о 'х о о о о д д О о й П3 . о а с х ы с я о $ а д «3 о а е м Ес о с х О х х о Я е. *5 о,х х о х а и о о е % Ф дд щ с н .О х Пс НП а « х а н х х е с 4 Ф н х— Ф Я 5 л О «с о Я а д а е х а а х н о Я е.
с ю а с е о а х с пс ох $$ х— д Ф щ с с н х Х П« о е Х «С х О а с х О. а О. н о е а 'Х О о о Ф С о х д е о с О х е ПП вЂ” о а с Я Х е с е й н О 3 а о о а ф х а Ф х 3« ье с о 3 Х е а е Б Я х н о с« Х о О «3 ПП ПЪ со «а а 03 х а" а а х о о е х е ФФ х Ь-с 3 а О. е 3 «3 с .х х с н д х 1 о П\ О. а х о Ф Фс о О О. х 8Я о о о е $ н Ф е о а х Ф 30 7 о Ф Х ф х щ о х а Ф л х 3 у а а О. д о О— х Нс с«а а а с х е о «а е о сд е а 5 сс 9.
>,, Наблвчвя клетки в сцвтовойваикроскг>п 927 ловиях можно зарегистрировать почти каждый распад и, следоват.льно, каждый распадающийся радиоактивный атом. Изо>п>пы расположены в порядке уменьшения энергии испускаемого 1) излучения (электронов). '«Ч также испускает у радиацию. Период полураспада — это время, необходимое для распада 50". атомов изотопа. 9.').') 7. РВДиОивОТОГ)ы исг)опьзуи>тсЯ ДЯЯ спвжвниЯ ЗВ йвопвкупвйви Внут)зй клвтОК и О)згвнизааОВ Одним из первых случаев применения радиоизотопов в биологии было от слеживанис химических прсврашсний углерода в процессе фотосинтеза. Одноклеточные зеленые водоросли выршцивали в атмосфере, содержащей радиоактивно меченый СО (>~СО. ).
В разные моменты времени после освещения их растворимое содержимое разделяли бумажной хроматографией. Малые молекулы, содержащие полученные из СО> атомы '"С, регистрировали при гюмощи листа фон>графической пленки, который клали поверх высохшей бумажной хроматограммы. Такой подход позволил идентис)>ицировать болыпинство ключевых кс>мпонентов процесса фотг>синтеза от СОз до сахара.
Радиоактивные молекулы можно использовать для наблюдения за ходом практически любого процесса в клетках. В типичном эксперименте клетки снабжают радиоактивной молекулой предшественником. Радиоактивные молекулы смешивают с исходно присутствовавшими в клетке нсмечеными соединениями; и те, и друп>с воспринимаются клеткой одинаково, поскольку они различаются только массой ядра атома. Изменения локализации или химической формы радиоактивных молекул можно отслеживать во времени. Разрешение таких экспериментов часто улучшается при использования про токола мечсния с вытеснением метки (рн!зс с)>аче), в котором радиоактивное вещество (стадия рп!зс) добавляют только на короткий промежуток времени, затем его отмывают и заменяют на нсрадиоактивные молекулы (стадия с)>аэе).
Через равные промсжутки времени собирав>т образцы, в каждом из которых определяют химическую форму или локализацию радиоактивной метки (рнс. 9.38). Эксперименты с вытеснением метки в сочетании с радиоавтографией сыграли важную роль, например, в определении того, как секреторные белки попадают из ЭР во внеклеточнос пространство. Радиои:н>тонное мечение является уникальным способом отличить химически идентичные, но обладаю>цие разной историей молекулы, например молекулы, син ДОБАВЛЕНИЕ ДОБАВЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОГО НЕРАДИОАКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ (Р(>ьЗЕ) СОЕДИНЕНИЯ (СНАЗЕ) Рис. 9.38. Логика типичного эксперимента с вытеснением метки с использованием радиоизотопов.
Камеры, помеченные А, 8, С и О, могут представлять собой либо различные компартменты клетки (регистрируемые радиоавтографией или экспериментами по фракционированик> клеток) или различные химические соединения (регистрируемые хроматографией или другими химическими методами), 92, Изучение клеток'молекул л электронный микроскоп 'И9 ' Рис. 9АО.
Радиоавтотрафия. Данную ткань непродолжительное время обрабатывали 'Н-тимидином. Клетки, реплицировавшие свою ДНК, включили метку в ядро, что позволило визуализировать их при помощи радиоавтографии. Серебряные зерна, видимые здесь на фотографической эмульсии на поверхности среза как черные гпочк, указывают на клетки, синтезирующие новую ДНК.
Изображенные здесь меченые ядра принадлежат нейрозпителию внутреннето уха цыпленка. (С любезного разрешения Маис Ъчагсно! и гелгеу Сопмп.) .Ъ ""' 20 мкм Доступно множество мепгодов оптической микроскопии, направленных на на блюдение клегпок. Фиксированньге и окрашенные клетки можно наблюдать в обыч ный световой микроскоп, тогда как связанные с флуоресцентными красителями антитела можно использовать для локализации опрег)еленных молекул в клетке ггри помощи флуоресцентного микроскопа.
Живые клетки можно наблюдать в фазово контрастном, дифференггггальном интерференционном контрастном, темнопольном и светлопольном .чикроскопах. Все виды световои микроскопии могут использовагпься в сочетании с методами обработки изображении, которые служат для усиления чувствительности и очистки изображения. Конфокальная микроскопия и обращенная свертка ггозв<ияют получать тонкие оптические срезы и воссоздавать трехмерные изображения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
