Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 187
Текст из файла (страница 187)
9.18). Этот процесс носит название непрямои гсчмгуног(гттохимггг!. В наиболее чувствительных методах усиления сигнала в качеств~ маркерной молекулы, спштой со вторичным антителом, используют фермент. Фермент щелоч ная фосфатаза, например, в присутствии соответствующих химических соединений дает неорганический фосфат, который, в свою очередь, приводит к образованию окрашенного осадка.
В результате можно определить локализацию вторичного аппп.ела и, следовательно, местоположение комплекса антиген антитело. Поскольку каждая молекула фермента катализирует реакцию образования тысяч молекул продукта, можно обнаружить даже очень маленькое количество антигена. Основанный на данном принципе твердофазный иммуноферментный анализ (англ. Епгуще 1зп)сес( 1пшшпобгзгЬеп1 Аззау, ЕЕ1БА) в планшетах часто используется в медицине в каче стае очень чувствительного метода анализа, например, в тестах на беременность или различные типы инфекций.
Несмотря на то что ферментативное усиление делает 908 Часть 11!. Методы процесса изготовления срезов мы теряем информацию о третьем пространственном измерении. Как тогда можно получить изображение трехмерной архитектуры клетки или ткани, и как мы можем увидеп. микроскопическую структуру образца, который, по какой-либо причине нельзя сперва нарезать? Несмотря на то что оптический микроскоп фокусируется на определенной фокальной плоскости в пределах сложного трехмерного образца, все остальные части образца, расположенные ниже и выше плоскости фокуса, также освещаются.
Свет, исходящий от этих областей, также вносит вклад в изображение, давая расфокусированную размытость. В результате интерпретация деталей изображения может значительно усложниться, а тонкая структура станет неясной за счет света «не в фокусе». Эзу проблему решают при помощи двух различных, но дополняюших друг друга подходов: вычислительного и оптического. Эти методы построения трехмерного микроскопического изображения позволяют сфокусироваться в толстом образце на выбранной плоскости, игнорируя свет, идуший от расфокусированных областей под и над этой плоскостью. Таким образом, можно увидеть четкий, тонкий оптический срез. Из набора таких оптических срезов, сделанных на разной глубине образца, на компьютере легко восстановить трехмерное изображение. Эти методы дают микроскопистам то же, что томография (другими способами) дает радиологам, изучающим человеческое тело: оба аппарата воссоздают подробные изображения срезов внутреннего устройства интактной структуры.
Вычислительный подход часто называют обращенной сеерткой изображения. Чтобы понять то, как он работает, вспомним, что за счет волновой природы света в системе линз микроскопа точечный источник света видится как маленький размьгтый диск (см. рис. 9.5). Его размытость возрастает, если источник света лежит ниже или выше фокальной плоскости. Такое размытое изображение точечного источника света называют функцией рассеяния точки. Тогда каждую точку препарата можно заменить на соответствующий размытый диск. В результате мы получим размытое изображение сложного объекта.
Для обрашенной свертки мы, обычно при помощи охлажденной камеры с ПЗС, сначала получаем набор (ршь мытых) изображений, поочередно фокусируя микроскоп на разных фокальных плоскостях. Затем набор цифровых изображений обрабатывается компьютером для максимально возможного избавления от размытости. По существу, компьютерная программа использует функцию рассеяния точки микроскопа для определения того, как повлияет размытость на изображение, и затем применяет эквивалентную «обратную размытость» (обрашенную свертку), превращая нечеткое трехмерное изображение в набор чистых оптических срезов.
Требуемые вычисления довольно сложны и раньше серьезно ограничивали исследователей. Однако сейчас, когда компьютеры стали быстрее и дешевле, метод обращенной свертки изображения набирает популярность. На рис. 9.19 показан пример применения данного подхода. 9.1.8. Конфокальный микроскоп позволяет получить оптические срезы путем исключения расфокусированного света Конфокальный микроскоп решает ту же задачу, что и обрашенная свертка, но путем манипуляции светом перед его измерением; это аналоговый метод, а не цифровой.
Оптическая система коифокальиого микроскопа очень сложна, но основной принцип, проиллюстрированный на рис. 9.20, довольно прост. По получаемым результатам конфокальная микроскопия значительно превосходит обычную оптическую микроскопию (рис. 9.21). 9Л. Наблюдая клетки в световой микроскоп 909 б) а) 5 мкм Рис. 9Д9. Обращенная свертка изображения.
а) Световая микрофотография крупной политенной хромосомы Пгозорлг!о, окрашенной ДНК-связывающим флуоресцентным красителем. б) После обращенной свертки изображения становится видна полосатоаь хромосом. Каждая полоса имеет ширину около 0,25 мкм, что близко к разрешающей способности микроскопа. (С любезного разрешения >оьп зеб аз 'саьо гас агу.) Обычно в микроскопе используют флуоресцентную оптику (смотри рис. 9.13), но, вместо того чтобы освещать весь образец одновременно, как это обычно делается, оптическая система в каждый момент времени фокусирует пятно света на единственной точке на определенной глубине образца.
Для этого требуется очень яркий точечный источник света; обычно используют лазер, пучок которого пропускают через диафрагму очень малого диаметра. Испускаемую освещаемым ве>цеством флуоресцепцик> собиран>г и переносят на изображение при помо щи подходящего детектора света. ПереЛ детектором устанавливают диафрагму с точечным отверстием в конфокальном положении по отношению к диафрагме лазера, то есть лучи, испускаемые освещенной точкой образца, находятся точно в фокусе.
Таким обра.юм, свет от этой точки препарата сходится на диафрагме и идет на детектор. С другой стороны, свет от областей вне фокальной плоскости освегцения так же находится не в фокусе точечной диафрагмы и, следовательно, большей частью отрезается от детектора (см. рис, 9.20). Для построг.ния двумерного изображения последовательно считывают данные с каждой точки фокалыюй плоскости путем растрового сканирования всей плоскости (как на экране телевизора).
Изображение выводится на видеоэкран. На рис 9.20 не показано, что сканирование обычно про изводится путем отражения луча колеблющимся зеркалом, расположенным между дихроичным зеркалом и линзой объектива так, чтобы г>свещающий пучок лазера и конфокальная диафрагма находились строго в одном регистре. Конфокальный микроскоп позволил расшифровать структуры множества сложных трехмерных обьектов (рис. 9.22), включая сети волокон цитоскелета в цитоплазме и распределение хромосом и генов в ядре.
Сравнительная ценность методов обращенной свертки и конфокалык>й микро скопин для трехмерной оптической микроскопии все еще остается под вопросом. 9.1. Наблюдая клетки в световой микроскоп 911 а) 10 мкм Рис. 9.21. Сравнение традиционной и конфокальной микроскопии, Это две микрофотографии одного итого же зародыша Огозорбдо на стадии гаструлы, окрашенного флуоресцентным зондом к актиновым филаментам. а) Обычное, необработанное изображение размыто из-за присутствия флуоресцирующих структур ниже и выше фокальной плоскости. б) На конфокальном изображении зта расфокусированная информация удаляется, и получается четкий оптический срез клеток зародыша.
(С любезного разрешения В(сиагг( ууагп и Ретег 5Ьаш.] дить поглощением двух (или более) фотонов меныпей энергии при условии, что они дгтстигают молекулы за фемтосекунду нли меньше. Применение такого возбуждения большей длиной волны несет несколько важных преимуществ. Помимо снижения фонового шума, красный или почти инфракрасный свет способен проникать глубже в образец. Мультифотонные конфокальные микроскопы, сконструированные с ис пользованием такого «двухфотонного» эффекта, обьпшо спгтсобтны давать четкнс изображения даже на глубине образца 0,5 мм. Это особенно ценно при изучении живых тканей, например, для визуализации динамической активности синапсов и нейронов вблизи поверхности живого мозга (рис. 9.23).
20 мкм Рис. 9.22. Трехмерная реконструкция изображений конфокального микроскопа. Пыльца, в данном случае страстоцвета, обладает сложной скульптурированной клеточной стенкой, содержащей флуоресцентные соединения. Изображения, полученные на разной глубине пыльцевого зерна, могут быть объединены для получения трехмерной структуры целой пылинки (показана справа). Три отдельных оптических среза из полного набора из 30, на каждом из которых почти не видно вклада соседних срезов, показаны слева (С любезного разрешения Вгад Аптоз.) 912 .
Часть 111. Методы Рис. 9.23. Мультифотонное получение изображений. Инфракрасный свет обладает меньшим повреждающим действием на живые клетки и способен проникать глубже в живые ткани. Двухфотонный эффект, при котором флуорохром может быть возбужден при одновременном поглощении двух инфра красных фотонов вместо единственного высокоэнергетического фотона, позволяет нам видеть на глубину 0,5 мм внутрь коры живого головного мозга мыши.
Краситель, флуоресценция которого изменяется в зависимости от концентрации кальция, позволяет увидеть изменяющиеся во времени активные синапсы (желгпые) на дендритных шипиках (красные). [С любезного разрешения Кате| зкоьоба.) 9Л З. Флуоресцентные белки можно использовать длл маркировании отдельных белкоВ В живых клетках и организмах Даже наиболее стабнльныг клеточные структуры должны быть собраны, разо браны и преобразованы в течение жизненного цикла клетки. Другие структур|я, часто огромного размера в молекулярном масштабе, быстро изменяются, движутся и перестраивают себя по мере того. как клетка управляет своими внутренними процессами и реви|руст на окружающук| среду. Сложньк|, высокоорганизованные элементы молекулярного аппарата перемещают компоненты по клетке, контролируя ДВиж|.'иие Внутрь яд)за и и:| и|.'ГО из ОднОЙ О)зганеллы В другую и В саму клетку и иэ нее.
Разработано несколько методов, поэволякпцих сделать определенные компоненты живых клеток виднмыл|и в микроскоп. Болыпинство этих подходов включает в себя использование флуоресцентных белков, и они требуют компромисса между сохранностью структуры и эффективным мечением. Все описанные вып|с флуорес центные молекулы синтезируются вне клетки и затем искусственно вводятся в нее. Сейчас, после обнаружения генов, кодирующих по своей природе флуоресцентные молекулы белков, |пкрыты новые возможности. Генная инженерия теперь позволяет создавать клеточные линии или организмы, синтезирующие свои собственные види мые маркеры и метки беэ введения чужеродных молекул. Такие клетки выставляют напоказ свое внутреннее устройство в ярком флуоресцентном свете.
Главным среди флуоресцентных белков, используемых для этих целей, является эеленьш флуоресцентный белок (Сггееп Г)погевсеп( Ргосе)п, СРР), выделенный из медузы Лег)иогга огсгогза. Этот белок в норме кодируется единственным геном, который можно клонировать и ввести в клетки других организмов. Синтезированный белок сначала не флуоресцирует, но где то через час (больше или меньше в случае некоторых аллелей генов) он претерпевает автокаталитические посзтрансляционные модификации для формирования эффективного и яркого флуоресцируюп|его центра, окруженного внутренним объемом бочкообразного белка (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
