Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 179
Текст из файла (страница 179)
В данном подходе короткий электрический разряд временно делает клеточную мембрану проницаемой, позволяя чужеродной ДНК приникнуть в цитоплазму. В отличие от высших эукариот (многоклеточных и диплоидных), бактерии, дрожжи и клеточный слизевик Жс~уоз~ейит обычно существуют в виде гаплоидных одиночных клеток. В этих организмах искусственно введенная молекула ДНК, несущая мутантный ген, с относительно большой частотой может заменить единственную копию нормального гена путем гомологичной рекомбинации; следовательно, легко получают клетки, в которых нормальный ген заменен на мутантный (рис. 8.6(>, а).
Таким образом, можно создавать клетки, у которых отсутствует определенный белок или синтезируется его альтернативная форма. Возможность проводить прямую замену генов в низ>пих эукариотах в сочетании с эффективностью стандартных методов генетического анализа в этих гаплоидных организмах в значительной степени объяс>иет, почему исследования этих типов клеток так важны для понимания механизмов клеточных процессов, свойственных всем эукариотам. В.Б. Изучение Вкспрессии и функционировения генов 869 плазмидный вектор вставленный клонирования нормальный гвн Ч.ььхгувьугев г)ггкьчв)кгк)ьт(вкгггт: Т. "' РАЗДЕЛЕНИЕ ЦЕПЕЙ У синтетический опигонукпеотидный праймвр, содержащий нужную мутантную последовательность пгстовг ! ЗАВЕРШЕНИЕ ЦЕПИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ И ДНК-ЛИГАЗОЙ ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТКИ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕПЛИКАЦИЕЙ И РАСХОЖДЕНИЕМ ПЛАЗМИД ПО ДОЧЕРНИМ КЛЕТКАМ ~ ТРАНСКРИПЦИЯ (т трянскрнпЦяя ~ тРАНОЛЯЦЫЯ сиювзярувтся бвгкж о вухагей Рис.
8.63. Использование синтетическик олигонуклеотидов для модификации кодирующего белок участка гена методом сайт-направленного мутагенеза, а) Рекомбинантная плазмида, содержащая вставку гена, разделяется на две цепи ДНК. Синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный части последовательности гена, но содержащий один измененный нуклеотид в определенной точке, добавляют к одноцепочечной ДНК в условиях, допускающих неидеальную гибридизацию (см. рис.
8.36). б) Праймер гибридизуется с ДНК, создавая одну некомплементэрную нуклеотидную пару. в) Рекомбинантную плазмиду делают двухцепочечной путем синтеза ДНК )и итго (начиная с праймера) и последующего сшивания разрывов ДНК лигазай, г) Двух цепочечную ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Реплика ция, использующая одну из цепей в качестве шаблона, дает нормальную молекулу ДН К, но реплика ция с другой цепью (той, которая содержит праймер) дает молекулу ДНК, несущую нужную мутацию.
Только половина клеток-потомков будет содержать ил аз миду с нужным муга нтным геном. Однако клетку-потомка, обладающую мугантным геном, можно идентифицировать, отделить от остальных клеток и культивировать для получения чистой популяции клеток, несущих мутацию. Показано только одно изменение, которое можно создать при помощи данного метода. При помощи олигонуклеотидов с соответствующей последовательностью можно за раз делать больше одной ам и иоки слотной замены, а также вставлять или удалять одну или несколько аминокислот.
На рисунке не показано, но можно создавать сайт-специфические мутации при помощи соответствующих олигонуклеотидов и ПЦР для амплификации мутантного гена (вместо репликации плазмид). Ча ть))). 88етоды нормдпьный гкйх зд(т)ЕНА ; Гйнд, нет активного гена активен только мутантный ген в) нормальный и мутантный ген активны в) Рис. 8.64. Замена, нокаут и добавление генов. Для создания трансгенного организма нормальный ген можно изменить несколькими способами.
а) Нормальный ген (зеленый) может быть полностью замещен его мутантной копией (красная]. Зто позволяет получить информацию об активности мутзнтного гена без вмешательства нормального гена, и, следовательно, можно наблюдать эффекты маленьких мутаций. 6) Нормальный ген можно полностью инзктивировзть, например, сделав в нем большую делецию. в) Мутантный ген можно просто добавить в геном. Для некоторых организмов зто самый простой в исполнении тип генетической инженерии. Такой подход может дать полезную информацию в случае, когда введенный мутантный ген подавляет функционирование нормального гена, например, при доминантно-негативной мутации (см.
рис. 8.62). Также возможно добавлять и заменять гены в животных и растениях, но методолопи в этом случае сложнее. Животные и растения, генетически модифицирован ные посредством вставки, удаления или замещения генов, называют транегенными организмами, а любые чужеродные или измененные гены — траисгеиами. Мы сконцентрируем наше внимание на трансгенных мышах, так как в этой области достигггут огромный прогресс. Если молекулу ДПК, несущую мутантный мыппшый ген, перенести в клетку мыши, она обычно встраивается в хромосому случайным образом, но примерно один раз из тысячя она замещает одну или две копии нормального гена путем гомологичной рекомбинации. Пользуясь этими редкими случаями направленного воздействия на гены, любой конкретный ген в клетке мыши можно путем прямой замены изменить или инактивировать. В таком особом случае, когда обе копии интересующего гена полностью инактивированы или удалены, получившихся животных называют «иокаутными» мышами.
Метод заклк>чается в следуктшем. На первом этапе фрагмент ДНК, содержащий мутантный ген (или фрагмент ДНК, направленный на нарушение последователь. ности гена мишени), вводят в вектор, а затем в культивируемые ЭС клетки (см. рис. 8.5), способные давагь клетки различных типов. После периода клеточной пролиферации выделяют редкие колонии клеток, в которых, вероятно, произошла гомологическая рекомбинация, приведшая к замене гена. Правильные колонии отбирают методами ПЦР или Саузерн-блоттинга: они будут содержать рекомби.
нэнтные последовательности ДНК, в которых введенный фрагмент частично или полностью заменил одну копию нормального гена. На втором этапе отдельные ЭС 85. Изучение экспрессии и функционирования генов 87 > клетки отобранной колонии помещают в тонкую микропипетку и вводят в ранний эмбрион мыши. Претерпевшие трансфекцию ЭС клетки взаимодействук>т с клетками эмбриона-хозяина, что приводит к формированию нормально выглядяшей мыши; некоторые части таких химерных животных, включая, если повезет, клетки зародышевой линии, часто развиваются из модифицированных ЭС клеток (рис.
8.65). Мышей с трансгеном в их зародышевой линии затем разводят для получения самки и самца, гетерозиготных по замене гена (то есть они несут одну нормальную и одну мутантную копию гена). При скрещивании этих двух мышей одна четвертая часть их потомства будет гомозиготна по модифицированному гену. Изучение таких гомозигот позволяет исследовать функционирование измененного гена или влияние инактивации гена в отсутствие соответствующего нормального гена. Возможность создавать трансгенных мышей, у которых отсутствует нормальный ген, стала прорывом. Сейчас метод используют для определения функций всех мышиных генов (рис.
8.66). Для создания условных мутантов, у которых функционирование интересующего гена нарушено в определенной ткани в конкретный момент развития, применяют специальные методы. Подход основан на сайт-специфическом вырезании— и, следовательно, удалении — системой рекомбинации гена-мишени в определенном месте или в определенное время. Наиболее распространена система рекомбинации, называющаяся Сге/1ох, которая широко используется для замены генов в мышах и растениях (см.
рис. 5.79). В данном случае ген-мишень в ЭС клетке заменяется на полностью функциональную версию гена, фланкированную парой коротких последовательностей ДНК, называемых 1ох-сайтами и узнаваемых белком рекомбиназой Сге. Получающиеся в результате трансгенные мыши обладают нормальным фенотипом. Их скрещивают с трансгенными мышами, у которых экспрессируется ген рекомбиназы Сге под контролем индуцируемого промотора.
В определенных клетках или тканях, в которых включают Сге, она катализирует рекомбинацию между 1ох-последовательностями, вырезая ген-мишень и инактивируя его. Сходные системы рекомб>инации используют для создания условных мутаций в ОгоюрЫа (см. рис. 22.49). Если исходная модификация гена полностью инактивирует его функцию, то таких гомозиготных мышей называют нокаутными. Когда у таких мышей отсутствуют гены, функционирующие во время развития, они часто погибают задолго до достижения зрелости.
Такие летальные дефекты подробно изучак>т для определения нормальной функции отсутствующего гена. 8.5.14. Трансгенные растения играют важную роль как в клеточной биологии, так и в сельском хозяйстве Поврежденное растение часто может восстановить себя при помощи процесса, во время которого зрелые дифференцированные клетки «дедифференцируются>ч пролиферируют и затем снова дифференцируются в другой тип клеток.
При некоторых условиях дедифференцированные клетки могут даже сформировать апикальную меристему, которая затем даст начало абсолютно новому растению, включая гаметы. Такая удивительная гибкость развития растительных клеток может быть использована для создания трансгенных растений из клеток, растущих в культуре. Когда образец ткани растения культивируют в стерильной среде, содержащей питательные вещества и соответствующие регуляторы роста, многие клетки пролиферируют бесконечно и беспорядочно, формируя массу относи>ельно недифференцированных клеток, называющуюся каллусом.
Аккуратная манипуляция питательными веШествами и регуляторами роста позволяет стимулировать формирование в каллусе 872 Часть)($,)У)етОДШ а) ЗС клетки, б) самка мыши растущие в культуре РЕЩИВАНИЕ, ТРЕХДНЕВНОЕ ОЖИДАНИЕ ' И СБОР РАННИХ ЭМБРИОНОВ ЕЛЕНИЕ '.::~ю"., аьщеленный ЗС КЛЕТОК ~~~~ ранний эмбрион В РАННИЙ ЭМБРИОН 'В ГИБРИДНЫЙ ЭМБРИОН, ЧАСТИЧНО ОБРАЗОВАННЫЙ ИЗ ЭС КЛЕТОК ВВЕДЕНИЕ ФРАГМЕНТА ДНК, СОДЕРЖАЩЕГО ИЗМЕНЕННЫЙ ГЕН, ВО МНОЖЕСТВО КЛЕТОК ВВ измененная версия гена-мишени, созданная КАЖДОЙ КЛЕТКЕ ДАЮТ РАЗМНОЖИТЬСЯ при помощи генной инже ( ПЕРЕНОС ГИБРИДНОГО ЭМБРИОНА В ПСЕВДОБЕРЕМЕННУЮ МЫШЬ „.Й' ЭС клетки, е которых одна копия нормального гена заменена на мутантный ген ЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ПОТОМСТВА ЯЮТ НА НАЛИЧИЕ ННОГО ГЕНА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
